El romero, una antigua planta medicinal, contiene una isoforma altamente eficaz.

Dec 20, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 644 (2023) Citar este artículo

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Los canales de potasio (Kv) dependientes de voltaje de la subfamilia KCNQ desempeñan funciones esenciales en el sistema nervioso, el corazón, los músculos y los epitelios. Es probable que diferentes complejos heteroméricos KCNQ cumplan funciones distintas en el cerebro, pero faltan moléculas pequeñas específicas del subtipo de heterómero para investigación o terapia. El romero (Salvia rosmarinus) es una planta de hoja perenne utilizada con fines medicinales durante milenios para trastornos neurológicos y de otro tipo. Aquí, informamos que el extracto de romero es un abridor altamente eficaz de los canales heteroméricos KCNQ3/5, con efectos débiles sobre KCNQ2/3. Mediante el análisis funcional encontramos que el ácido carnósico, un diterpeno fenólico del romero, es un abridor de KCNQ3 potente, altamente eficaz y resistente al agotamiento de PIP2, con menores efectos sobre KCNQ5 y ninguno sobre KCNQ1 o KCNQ2. El ácido carnósico también es altamente selectivo para los heterómeros KCNQ3/5 sobre KCNQ2/3. La química medicinal, el acoplamiento in silico y la mutagénesis revelan que el enlace iónico carboxilato-guanidinio con un conector arginina S4-5 subyace a la capacidad de apertura del ácido carnósico en KCNQ3, cuyos efectos sobre KCNQ3/5 sugieren un potencial terapéutico único y una base molecular para la antigua Uso neuroterapéutico del romero.

Los canales de potasio (Kv) dependientes de voltaje proporcionan un conducto para que los iones K+ se difundan rápidamente a través de la membrana plasmática en un proceso estrechamente regulado, esencial para la excitabilidad celular y la repolarización oportuna de la membrana celular. Los canales Kv de la subfamilia KCNQ (Kv7) son extraordinariamente diversos en las funciones que desempeñan, los tejidos en los que se expresan y los procesos fisiológicos que facilitan1. Esta versatilidad se explica en gran medida por la capacidad de las subunidades α formadoras de poros de KCNQ para heteromultimerizarse, tanto entre sí como con las subunidades reguladoras, especialmente las de las subunidades KCNE transmembrana de paso único. La formación de complejos con las subunidades KCNE es especialmente importante para KCNQ1, que puede formar complejos con cada una de las cinco isoformas de KCNE (1 a 5) con características dramáticamente diferentes que permiten funciones en diversos tejidos, incluidos el corazón, la tiroides, el páncreas, el oído interno y el tracto gastrointestinal. y plexo coroideo2. Para KCNQ2–5, la mayor parte de la diversidad surge de la heteromerización intrasubfamiliar3,4,5, aunque los canales KCNQ4/5 forman complejos con KCNE4 en la vasculatura, por ejemplo6,7.

En el sistema nervioso central, las subunidades primarias de KCNQ son KCNQ2, 3 y 5, y se cree que KCNQ4 tiene un perfil de expresión más limitado en las neuronas auditivas (y las células ciliadas del oído interno). Los heterómeros KCNQ2/3 se consideran el tipo de canal KCNQ neuronal dominante y el más importante para generar la corriente M neuronal (corriente inhibida por el receptor muscarínico) que es esencial para el control de la excitabilidad neuronal. De hecho, los canales KCNQ2/3 actúan como guardianes neuronales, ubicados en el segmento inicial del axón para controlar si los potenciales de acción se propagan o no. La actividad reducida de KCNQ2 o KCNQ3, por mutaciones de pérdida de función en humanos, knockout en ratones o inhibición farmacológica, conduce a hiperexcitabilidad neuronal y trastornos que incluyen convulsiones y retraso en el desarrollo. Los canales KCNQ3/5 también pueden aparecer en el SNC, y recientemente se detectaron complejos KCNQ2/5 y KCNQ2/3/5 mediante técnicas de química de proteínas3,4,5.

Las variantes del gen de pérdida de función KCNQ2 están estrechamente asociadas con la encefalopatía epiléptica de inicio neonatal, pero las mutaciones de pérdida de función KCNQ3 y KCNQ5, y las mutaciones de ganancia de función en cada uno de los tres, también se asocian con epilepsia de diversos grados. de gravedad y retraso en el desarrollo8,9,10.

Comprender el papel de las isoformas neuronales de KCNQ en la fisiología y las enfermedades neurológicas es un desafío dada la complejidad combinatoria de los diferentes posibles complejos heteroméricos de KCNQ en el SNC, su expresión espacial y temporal diferencial, la naturaleza potencialmente dinámica de su expresión y la posibilidad de que existan tanto homoméricos como heteroméricos. Canales KCNQ que se expresan4. Faltan moléculas pequeñas específicas con la capacidad de distinguir entre diferentes heterómeros KCNQ en el cerebro, para fines de investigación y/o terapéuticos, y están muy justificadas. Estamos explorando el potencial de las plantas como fábricas de productos químicos para proporcionar moduladores selectivos de canales iónicos, a menudo guiados por el uso tradicional de medicinas botánicas populares11,12,13,14,15,16. Aquí, informamos que el romero (Salvia rosmarinus), utilizado en la medicina tradicional durante milenios, especialmente para trastornos neurológicos y para mejorar la memoria, es un eficaz activador del canal neuronal KCNQ con una selectividad heterómera única, cuya base química y mecánica molecular se explica.

El romero es una planta con flores de hoja perenne con hojas aromáticas en forma de aguja (Fig. 1a) y racimos de delicadas flores de color blanco a azul pálido (Fig. 1b). Dada la larga historia del uso medicinal tradicional del romero para una variedad de supuestos efectos, incluidos sedantes, analgésicos, antiparalíticos y mejora de la memoria17, probamos el extracto de romero (1%) para determinar los efectos sobre los canales KCNQ, que son muy influyentes en la función neuronal. , primero como homómeros expresados ​​en ovocitos de Xenopus laevis. El extracto de romero no tuvo ningún efecto sobre las corrientes endógenas registradas en los ovocitos inyectados con agua en lugar de ARNc de KCNQ (Fig. 1c), ni el extracto de romero alteró la magnitud de la corriente de KCNQ1 (Fig. 1d), la dependencia del voltaje de KCNQ1 (Fig. 1e, f), o el potencial de membrana en reposo (EM) de ovocitos no fijados que expresan KCNQ1 (Fig. 1g).

a Hojas de Salvia rosmarinus (imagen: Bo Abbott, utilizada con autorización). b Flores de Salvia rosmarinus (imagen: GWA). c Trazas medias de ovocitos inyectados con agua en ausencia (control) o presencia de extracto de RAP 1:100. Las líneas discontinuas indican línea actual cero aquí y en todas partes. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. d Trazas medias de homómeros KCNQ1–3 expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de extracto de RAP 1:100. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5–10 por grupo. e Corriente de cola media para trazas como en (d); n = 5–10 por grupo. f Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas como en (d); n = 5–10 por grupo. g Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan homómeros KCNQ1-3 como en d; n = 5 por grupo. h Aumento medio de la corriente frente al potencial de membrana para trazas como en d en respuesta al extracto de RAP 1:100; n = 5–10 por grupo. i Activación media de ΔV0.5 para trazas como en (d) en respuesta al extracto de RAP 1:100; n = 5–10 por grupo. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante prueba t pareada o ANOVA unidireccional. Partes aéreas de romero RAP.

El extracto de romero hiperpolarizó débilmente la dependencia del voltaje de activación de KCNQ2 y KCNQ3 * homoméricos (KCNQ3-A315T, un mutante que permite que KCNQ3 homomérico pase corrientes robustas18) (Fig. 1d-f). Este efecto facilitó una hiperpolarización EM moderada (~ 10 mV) por el extracto de romero de ovocitos que expresan KCNQ3 (con una tendencia estadísticamente no significativa para los ovocitos que expresan KCNQ2) (Fig. 1g). Los aumentos en la corriente inducida por el extracto de romero fueron mayores entre −40 y −60 mV y mayores en KCNQ3* que en KCNQ2 (Fig. 1h). El cambio en la dependencia del voltaje de la activación inducida por el extracto de romero fue similar para KCNQ2 y KCNQ3* (~ −10 mV) (Fig. 1i; Tabla complementaria 1).

Los efectos moderados del extracto de romero sobre los homómeros no parecen suficientes para explicar los efectos terapéuticos del romero, por lo que a continuación probamos extractos de diferentes partes de la planta de romero en el heterómero predominante generador de corriente M, KCNQ2/3. Descubrimos que los tres indujeron aumentos menores esencialmente similares en la corriente en potenciales hiperpolarizados (Fig. 2a, b), hiperpolarización en la dependencia del voltaje de la activación de KCNQ2/3 (-7 a -10 mV) (Fig. 2c-e) y hiperpolarización de EM (Fig. 2f). Ninguna de las partes de romero probadas afectó consistentemente la tasa de activación (Fig. 2g), pero cada una de las tres ralentizó consistentemente la desactivación (Fig. 2h). Como los efectos sobre los heterómeros KCNQ2/3 fueron moderados, probamos KCNQ3/5, un heterómero que se cree que también genera corriente M19,20. Inesperadamente, el extracto de romero (1/100) abrió fuertemente KCNQ3/5 (Fig. 2i), induciendo un cambio de -28 mV en su dependencia del voltaje de activación y una disminución de la pendiente de la dependencia del voltaje (de 7,9 a 12,1 mV). de modo que el 20% de los canales KCNQ3/5 estaban abiertos a -120 mV (Fig. 2j, k; Tabla complementaria 2). Esto resultó en una hiperpolarización de −17 mV de EM, desplazándola al valor esperado para EK (Fig. 2l).

a Trazas medias de heterómeros KCNQ2/3 expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de extracto 1:100 de partes de romero como se indica. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción inferior del protocolo de voltaje; n = 5–11 por grupo. b Corriente de cola media para trazas KCNQ2/3 como en a; n = 5–11 por grupo. c Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas KCNQ2/3 como en a; n = 5–11 por grupo. d Aumento medio de la corriente frente al potencial de membrana para trazas de KCNQ2/3 como en A en respuesta a extractos 1:100 como se indica; n = 5–11 por grupo. mi. Activación media de ΔV0.5 para trazas de KCNQ2/3 como en (a) en respuesta a extractos 1:100 como se indica; n = 5–11 por grupo. f Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ2/3 como en (a); n = 5–11 por grupo. g Tasa de activación media para trazas de KCNQ2/3 como en (a) en respuesta a extractos 1:100 como se indica; n = 5–11 por grupo. h Tasa de desactivación media para trazas de KCNQ2/3 como en (a) en respuesta a extractos 1:100 como se indica; n = 5–11 por grupo. i Trazas medias de heterómeros KCNQ3/5 expresados ​​en ovocitos en ausencia (Control) o presencia de extracto 1:100 de partes aéreas de romero. Barras de escala abajo a la izquierda; protocolo de voltaje como en (a); n = 5. j Corriente de cola media para trazas KCNQ3/5 como en (i); n = 5. k Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas KCNQ3/5 como en (i); n = 5. l Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan heterómero KCNQ3/5 como en (i); n = 5. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante prueba t pareada o ANOVA unidireccional. Partes aéreas de romero RAP, flor de romero RF, tallo de romero RS.

A continuación, analizamos compuestos previamente establecidos para componer el extracto de romero21, para descubrir la base molecular de sus efectos moduladores de KCNQ, centrándonos primero en KCNQ3. Una pantalla con 7 compuestos (Fig. 3a) cada uno a 100 µM (excepto la hesperidina, que era soluble hasta 30 µM) reveló que el ácido fenólico diterpeno carnósico es un abridor de KCNQ3* altamente eficaz, que induce un cambio negativo de −62 mV en su dependencia del voltaje de activación (V0.5act) a 100 µM y promoción de una actividad robusta incluso a −120 mV (Fig. 3b-d). Además, la hesperidina y el ácido quínico indujeron cada uno cambios de ~ −10 mV en KCNQ3* V0.5act (Fig. 3d; Tabla complementaria 3). Solo el ácido carnósico y la hesperidina hiperpolarizaron el EM de las células que expresaban KCNQ3 * (Fig. 3e).

a Gráficos en Jmol de estructura (superior) y carga superficial (inferior) para compuestos de romero como se indica. b Trazas medias de homómeros de KCNQ3* expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de compuestos de romero de 30 a 100 µM, como se indica. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 3–5 por grupo. c Corriente de cola media para trazas KCNQ3* como en (b); n = 3–5 por grupo. d Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas KCNQ3* como en (b); n = 3–5 por grupo. e Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ3* como en (b); n = 3–5 por grupo. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante prueba t pareada o ANOVA unidireccional.

A 5 µM, el ácido carnósico potenció fuertemente la corriente KCNQ3* a −60 mV tras el lavado, saturándose alrededor de 150 s, mientras que el lavado del efecto fue mucho más lento (Fig. 4a). La CE50 para el aumento de corriente a −60 mV fue de 5,43 ± 0,37 µM (Fig. 4b); la CE50 para ΔV0.5act fue de 18 ± 0,72 µM (Fig. 4c) y la CE50 para cambiar el EM de ovocitos sin pinzar que expresaban KCNQ3* fue de 1,19 ± 0,19 µM (Fig. 4d). El ácido carnósico duplicó de forma independiente la tasa de activación (Fig. 4e, f) y dependiente del voltaje ralentizó la tasa de desactivación (> cuatro veces a −120 mV) (Fig. 4g, h) de KCNQ3 *. Por el contrario, el ácido carnósico solo fue débilmente activo contra KCNQ2 y KCNQ2/3 en todo el rango de concentración analizado (Fig. 4i-n; Tabla complementaria 4). Por lo tanto, el ácido carnósico es altamente selectivo para KCNQ3 sobre KCNQ2, y la sensibilidad reducida de KCNQ2 al ácido carnósico es dominante en los heterómeros KCNQ2/3.

a Gráfico de ejemplo que muestra el lavado (rojo) y el lavado parcial (negro) de ácido carnósico (5 µM) a −60 mV en KCNQ3* expresado en ovocitos. Inserto superior, estructura de ácido carnósico. b Aumento medio de la corriente actual frente a [ácido carnósico] a −60 mV para KCNQ3*; n = 5 por grupo. c Media ΔV0.5act frente a [ácido carnósico] para ovocitos que expresan KCNQ3*; n = 5 por grupo; protocolo de voltaje como en la Fig. 3b. d EM media versus [ácido carnósico] para ovocitos no pinzados que expresan KCNQ3*; n = 5 por grupo. e Trazas medias de KCNQ3* que muestran el efecto del ácido carnósico (3 µM) (rojo) en la activación. Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. f Tasa de activación media versus voltaje para trazas de KCNQ3* como en f en todo el rango de voltaje en ausencia (círculos negros) o presencia (círculos rojos abiertos) de ácido carnósico 3 µM; n = 5 por grupo. g Trazas medias de KCNQ3* que muestran el efecto del ácido carnósico (3 µM) sobre la desactivación. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 8 por grupo. h Tasa de desactivación media versus voltaje para trazas de KCNQ3* como en g en ausencia (círculos negros) o presencia (círculos rojos abiertos) de ácido carnósico 3 µM; n = 8 por grupo. i Trazas medias de KCNQ2 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia (azul) de ácido carnósico 100 µM. Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. j Trazas medias de KCNQ2/3 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia (marrón) de ácido carnósico 100 µM. Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. k Corriente de cola media y corriente de cola normalizada (G/Gmax) para trazas KCNQ2 como en (I); n = 5 por grupo. l Corriente de cola media (izquierda) y corriente de cola normalizada (G/Gmax) (derecha) para trazas KCNQ2/3 como en (j); n = 5 por grupo. m Media ΔV0.5act frente a [ácido carnósico] para ovocitos que expresan KCNQ2 o KCNQ2/3, con datos de KCNQ3* del panel c para comparación; n = 5 por grupo; protocolo de voltaje como en (I). n .Media ΔEM versus [ácido carnósico] para ovocitos que expresan KCNQ2 o KCNQ2/3, con datos de KCNQ3* (calculados a partir del panel d) para comparación; n = 5 por grupo; protocolo de voltaje como en el panel i. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes.

En condiciones iniciales, la unión de la molécula de señalización soluble derivada de lípidos fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) a KCNQ3 (y otras isoformas de KCNQ) es necesaria para un acoplamiento eficiente del sensor de voltaje a la apertura de los poros y, por lo tanto, a la activación dependiente del voltaje22. 23. Aquí, la reducción de los niveles de PIP2 mediante el tratamiento previo con wortmanina redujo la magnitud de la corriente de KCNQ3* ~ cinco veces, pero el ácido carnósico (5 µM) aún pudo cambiar el KCNQ3* V0.5act (Fig. 5a, b) y EM (Fig. 5c). en estas condiciones, aunque el ΔV0.5act fue ~ 50% del que se encontraba en condiciones repletas de PIP2 (Fig. 5d). Otra estrategia para la reducción de PIP2 es expresar una fosfatasa sensible al voltaje (VSP) que reduce los niveles de PIP2 tras la despolarización de la membrana24. Aquí, coexpresamos el Danio rerio VSP (DrVSP)25 con KCNQ3* y encontramos que después de 12 s a +120 mV, la corriente de KCNQ3* decayó en un 50%. Sorprendentemente, el ácido carnósico (5 µM) redujo o evitó la caída de corriente de KCNQ3 * inducida por DrVSP en condiciones similares (Fig. 5e, f; Tabla complementaria 5). Curiosamente, previamente observamos que la unión de GABA es capaz de abrir los canales KCNQ2/3 después del pretratamiento con wortmannina26.

a Trazas medias de KCNQ3* expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia de ácido carnósico (5 µM) con o sin pretratamiento con wortmanina para agotar PIP2. Barras de escala en la parte inferior izquierda para cada trazo; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5–9 por grupo. b Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas KCNQ3* como en a; n = 5–9 por grupo. c Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ3* como en a; n = 5–9 por grupo. d ΔV0.5act inducido por ácido carnósico (5 µM) para KCNQ3* expresado en ovocitos como en (a), en ausencia (negro) o presencia (púrpura) de pretratamiento con wortmanina; n = 5–9 por grupo. e Trazas medias de KCNQ3* coexpresado en ovocitos con DrVSP en ausencia (negro; Control) o presencia (rojo) de ácido carnósico (5 µM), pulsado a +120 mV para activar VSP y agotar PIP2; protocolo de voltaje, recuadro superior; n = 5. f Caída de corriente media para el período entre flechas en el panel e para KCNQ3* en ausencia (Control) o presencia (CA) de ácido carnósico (5 µM); n = 5. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante prueba t o ANOVA unidireccional.

De los otros compuestos de romero probados (Fig. 6a), solo la hesperidina abrió los canales KCNQ2/3 (desplazamiento de -10,4 mV V0.5act a 30 µM) (Fig. 6b-d) e hiperpolarizó el EM de los ovocitos que expresan KCNQ2/3 ( Fig. 6e), pero la hesperidina no abrió KCNQ2 (Fig. 6f-i; Tabla complementaria 6), lo que indica que, a diferencia del ácido carnósico, los efectos de la hesperidina sobre KCNQ3* (Fig. 3) son dominantes en los complejos KCNQ2/3. Los débiles efectos de apertura tanto de la hesperidina como del ácido carnósico probablemente subyacen a la débil capacidad de apertura de KCNQ2/3 del extracto de romero.

a Gráficos en Jmol de estructura (superior) y carga superficial (inferior) para compuestos de romero como se indica. b Trazas medias de heterómeros KCNQ2/3 expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de compuestos de romero 30 o 100 µM (rojo), como se indica. Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 4-5 por grupo. c Corriente de cola media para trazas KCNQ2/3 como en (b); n = 4–5 por grupo. d Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas KCNQ2/3 como en (b); n = 4-5 por grupo. e Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ2/3 como en b; n = 4–5 por grupo. ( f ) Trazas medias de homómeros de KCNQ2 expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de hesperidina 30 µM (rojo). Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 4 por grupo. (g) Corriente de cola media para trazas de KCNQ2 como en (f); n = 4 por grupo. (h) Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para trazas de KCNQ2 como en (f); n = 4 por grupo. i Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ2 como en (f); n = 4 por grupo. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante ANOVA unidireccional.

El ácido carnósico también activó KCNQ5, induciendo un cambio relativamente pequeño (−7,2 mV) en V0.5act (a 100 µM) pero, más notablemente, un componente (~ 5%) de la corriente constitutivamente activada incluso a −120 mV (Fig. 7a -C). Sorprendentemente, el ácido carnósico (100 µM) fue un poderoso abridor de los canales heteroméricos KCNQ3/5 y también superó la relativa insensibilidad de KCNQ2 que dominaba la respuesta de los heterómeros KCNQ2/3 (Fig. 4) para cambiar negativamente la dependencia del voltaje de la activación de Se cree que los heterómeros KCNQ2/5 y KCNQ2/3/5, ambos, como KCNQ3/5, contribuyen a la corriente M neuronal5 (Fig. 7a-c). En consecuencia, el ácido carnósico hiperpolarizó el EM en ovocitos que expresaban homómeros y heterómeros que contenían KCNQ5 (Fig. 7d). Los estudios de respuesta a la dosis de ácido carnósico revelaron que los efectos sobre KCNQ3/5 fueron intermedios entre los de los homómeros de KCNQ3 y KCNQ5 (Fig. 7e, f), al igual que los efectos sobre KCNQ2/5 y KCNQ2/3/5 (Fig. 7g, h) ( Cuadro complementario 7). Por lo tanto, el ácido carnósico probablemente sea la base de la capacidad de apertura KCNQ3/5 del extracto de romero (Fig. 2i-l).

a Trazas medias de homómeros y heterómeros que contienen KCNQ5 neuronal como se indica, expresados ​​en ovocitos en ausencia (control) o presencia de ácido carnósico (100 µM) (rojo). Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. b Corriente de cola media para canales como en el panel a; n = 5 por grupo. c Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para canales como en el panel a; n = 5 por grupo. d Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan canales como en el panel A; n = 5 por grupo. e Media ΔV0.5act versus [ácido carnósico] para canales como se indica; n = 5 por grupo; Datos KCNQ3* de la Fig. 4C para comparación. F. Media ΔEM versus [ácido carnósico] para ovocitos no pinzados que expresan canales como se indica; n = 5 por grupo. Datos KCNQ3* calculados a partir de la Fig. 4D para comparación. g Media ΔV0,5act versus [ácido carnósico] para canales como se indica; n = 5 por grupo; Los datos de KCNQ2, KCNQ3 y KCNQ2/3* de la Fig. 4 se incluyen para comparación. h Media ΔEM versus [ácido carnósico] para ovocitos no pinzados que expresan canales como se indica; n = 5 por grupo. Los datos de KCNQ2, KCNQ3* y KCNQ2/3 de la Fig. 4 se incluyen para comparación. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante prueba t o ANOVA unidireccional.

Debido a los fuertes efectos de apertura del ácido carnósico en los canales KCNQ3 y KCNQ3/5, y a nuestros hallazgos previos de sinergia entre moléculas pequeñas que se dirigen preferentemente a diferentes isoformas en los heterómeros KCNQ12, probamos la combinación de ácido carnósico y el abridor selectivo de KCNQ5, la aloperina15. (Fig. 8a) en KCNQ3/5. La aloperina (5 µM) fue un abridor débil de KCNQ3/5, mientras que la posterior adición de ácido carnósico (5 µM) en presencia de aloperina debilitó aún más, paradójicamente, el efecto de apertura (Fig. 8b, c) y la capacidad de inducir la hiperpolarización de KCNQ3/5. de EM (Fig. 8d; Tabla complementaria 8). Esto sugirió un impedimento estérico entre las dos moléculas pequeñas, consistente con un sitio de interacción similar para las dos. Anteriormente descubrimos que la aloperina se une cerca de R212 en el conector KCNQ5 S4-515. Aquí, el ácido carnósico en silico se acopló cerca de la arginina equivalente y su vecino en la estructura derivada de crio-EM del KCNQ2 humano (R213, R214)27 y al modelo AlphaFold28,29 del KCNQ3 humano (R242, R243) (Fig. .8e). Curiosamente, el acoplamiento in silico predijo la formación de enlaces iónicos entre el ácido carnósico a través de su grupo carboxilato y el grupo guanidinio de R243 en KCNQ3, pero no en KCNQ2 (Fig. 8e; primer plano en la Fig. 8f). Todavía no entendemos qué influencia tiene el entorno KCNQ3 frente al KCNQ2 alrededor del R243 en esta diferencia prevista en la interacción con el ácido carnósico.

una estructura de aloperina. b Trazas medias de KCNQ3/5 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia de aloperina y/o ácido carnósico (5 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 5 por grupo. c Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para KCNQ3/5, farmacología como en el panel B; n = 5 por grupo. d Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ3/5; farmacología como en (b); n = 5 por grupo. mi. Resultados del acoplamiento in silico para aloperina en un modelo KCNQ5; ácido carnósico en estructura derivada de crio-EM KCNQ256,57 y en un modelo KCNQ3 AlphaFold. f Primer plano del acoplamiento del ácido carnósico a la estructura del modelo KCNQ3 que muestra el enlace iónico previsto entre el grupo carboxilo del ácido carnósico y el grupo guanidinio R243 (verde). g Trazas medias de KCNQ3* mutante (como se indica) expresado en ovocitos en ausencia (control) o presencia de ácido carnósico (100 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; protocolo de voltaje como en (b); n = 4–10 por grupo. h Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para mutantes KCNQ3* en ausencia (negro) o presencia (rojo) de ácido carnósico; n = 4–10 por grupo. N/A, no aplicable. i Potencial de membrana de ovocitos libre medio para ovocitos que expresan mutantes KCNQ3* en ausencia (negro) o presencia (rojo) de ácido carnósico; n = 4–10 por grupo. N/A no aplicable. j Media ΔV0,5act frente a [ácido carnósico] para R242A KCNQ3*; n = 4–10 por grupo; datos de KCNQ3* de tipo salvaje de la Fig. 4 para comparación. k Media ΔEM frente a [ácido carnósico] para R242A KCNQ3*; n = 4–10 por grupo; datos de KCNQ3* de tipo salvaje de la Fig. 4 para comparación. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante ANOVA unidireccional y prueba t pareada.

Para probar las predicciones, primero realizamos una mutagénesis con escaneo de alanina de KCNQ3-R242, R243 y residuos cercanos, y descubrimos que la mutación de R242 o R243 disminuía en gran medida los efectos del ácido carnósico (100 µM), en particular la capacidad de abrir KCNQ3* en potenciales fuertemente hiperpolarizados (Fig. 8g, h; Tabla complementaria 8; para comparar la dependencia del voltaje basal mutante versus de tipo salvaje, consulte la Fig. 1 complementaria), aunque el ácido carnósico retuvo la capacidad de hiperpolarizar EM porque esto ocurre con potenciales menos hiperpolarizados (Fig. .8i). Un estudio de dosis-respuesta mostró que la mutación R242A redujo a la mitad la eficacia del ácido carnósico en términos de ΔV0.5act (Fig. 8j), mientras que no pudimos interpretar sin ambigüedades la respuesta a la dosis para el cambio de ΔEM ya que no se saturó en la dosis más alta posible de ácido carnósico (Fig. 8k).

Curiosamente, la mutación a alanina de R239 o D241 dio como resultado canales no funcionales, lo que sugiere la importancia de estos residuos en la activación del canal o posiblemente en el plegamiento de proteínas. KCNQ3*-M240A tenía una dependencia del voltaje de activación con desplazamiento positivo en comparación con KCNQ3* pero todavía estaba fuertemente abierto por el ácido carnósico (100 µM), con un 20% de corriente constitutiva a −120 mV. KCNQ3*-G244A se comportó de manera indistinguible de KCNQ3* con respecto tanto a la actividad inicial como a los efectos del ácido carnósico. La dependencia del voltaje de activación del punto medio de KCNQ3 * -G245A se desplazó -32 mV en comparación con KCNQ3 *, pero aún mostró una sensibilidad sólida al ácido carnósico (desplazamiento de -45 mV en la dependencia del voltaje de activación del punto medio con ácido carnósico 100 µM (Fig. 8g, h; Suplementario Tabla 8).

A continuación, probamos los efectos sobre la apertura del ácido carnósico de la mutación KCNQ3-W265, un residuo esencial para la unión de retigabina y GABA a KCNQ326,30,31, y también P211 y L198, residuos identificados por otros como importantes para determinar la selectividad diferencial de ICA069673 para KCNQ2. frente a KCNQ332. El ácido carnósico mostró una eficacia de apertura similar para los canales KCNQ3* y KCNQ3*-W265L, aunque este último fue aproximadamente cinco veces más sensible en términos de potencia (Fig. 9a-c). Los canales KCNQ3*-P211A y KCNQ3*-L198F se comportaron de manera muy similar a KCNQ3* en términos de eficacia y potencia del ácido carnósico (Fig. 9a-c).

a Trazas medias de canales KCNQ3* de tipo salvaje y mutantes como se indica en ausencia (control) y presencia de ácido carnósico (100 µM), n = 4 para L198F, 5 para otros. b Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) versus voltaje para trazas como en (a), n = 4 para L198F, 5 para otros. c Media ΔV0.5act versus [ácido carnósico] para mutantes KCNQ3* como se indica; n = 4 para L198F, 5 para otros; datos de KCNQ3* de tipo salvaje de la Fig. 4 para comparación. d Media ΔV0.5act para canales KCNQ3* de tipo salvaje y mutantes; n = 4 para L198F, 5 a 10 por grupo para otros; NF no funcional. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante ANOVA unidireccional. Protocolo de tensión como en la Fig. 8.

La comparación de los cambios en V0.5act, R242A y R243A redujo con mayor fuerza la eficacia del ácido carnósico, seguido de la mutación de cualquiera de los tres residuos proximales (M240A, G244A, G245A) (Fig. 9d; Tabla complementaria 9). En general, los datos sugieren fuertemente que KCNQ3 R242 y R243 son componentes importantes de la interacción del ácido carnósico y/o sus efectos funcionales.

Los estudios de acoplamiento in silico y mutagénesis in vitro (Figs. 8 y 9) sugieren que la activación del ácido carnósico de KCNQ3* se ve facilitada por el enlace iónico entre el grupo carboxilato del ácido carnósico y el grupo guanidinio de KCNQ3*-R243 (Fig. 10a, b). A continuación, acoplamos in silico ácido carnósico al mutante KCNQ3 (R242A y/o R243A) y descubrimos que las mutaciones individuales disminuyeron la energía libre de unión predicha (ΔG) y que se redujo aún más con la mutación doble; Las mutaciones R243A y R242A, R243A también eliminaron la formación de enlaces iónicos predicha descrita anteriormente (Fig. 10b). Para probar más a fondo la importancia de estas interacciones, sintetizamos y probamos varios compuestos relacionados con el ácido carnósico para determinar su actividad de apertura KCNQ. El ácido carnósico exhibe un potencial de superficie electrostático negativo centrado en el grupo carboxilato que se predice que facilitará la unión a KCNQ3 (Fig. 10c). El carnosol, también presente en el romero21, carece del grupo carboxilato presente en el ácido carnósico, pero exhibe un potencial superficial electrostático negativo previsto en el mismo lado de la molécula que el ácido carnósico, pero no exactamente en la misma ubicación y esto se contrarresta con un potencial positivo previsto en el lado distal de la molécula (Fig. 10c). Por lo tanto, no se predijo que el carnosol formaría un enlace iónico con el grupo guanidinio R243 (Fig. 10d) y a 100 µM produjo solo un cambio negativo débil de −11 mV en KCNQ3* V0.5act (en comparación con un cambio negativo de −62 mV para ácido carnósico a 100 µM, Fig. 3c, d) y sin cambio para KCNQ2 o KCNQ2/3 (Fig. 10e, f). De manera similar, el carnosol no alteró la EM de los ovocitos que expresan KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 (Fig. 10g). Luego agregamos dos grupos metilo al carnosol, creando dimetil carnosol, que tiene un perfil de carga superficial algo más similar al del ácido carnósico (Fig. 10c), pero no puede formar un enlace iónico con R243 (Fig. 10d), y solo indujo un cambio hiperpolarizante de -3,2 mV en KCNQ3* V0.5act (Fig. 10e, f), aunque fue capaz de hiperpolarizar EM en> 8 mV (Fig. 10g).

a Estructura del ácido carnósico destacando el grupo carboxilo. b Acoplamiento in silico de ácido carnósico a modelos KCNQ3 de tipo salvaje y mutante. c Estructuras y potenciales superficiales electrostáticos (rojo, negativo; azul, positivo) del ácido carnósico y derivados según se indica. d Acoplamiento in silico de ácido carnósico y derivados al modelo KCNQ3 de tipo salvaje. e Trazas medias de KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 expresadas en ovocitos en ausencia (Control) o presencia de derivados del ácido carnósico (100 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 4–10 por grupo. f Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de compuestos como en (e); n = 4–10 por grupo. g Potencial de membrana de ovocitos libre medio para ovocitos que expresan KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de compuestos como en (e); n = 4–10 por grupo; DMC dimetilcarnosol. h Estructuras y potenciales superficiales electrostáticos (rojo, negativo; azul, positivo) de los derivados del ácido carnósico como se indica. i Acoplamiento in silico de derivados del ácido carnósico al modelo KCNQ3 de tipo salvaje. j Trazas medias de KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia de γ-lactona de ácido carnósico (10 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; protocolo de voltaje como en (b); n = 5–10 por grupo. k Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de γ-lactona de ácido carnósico (10 µM); n = 5–10 por grupo. l Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de γ-lactona de ácido carnósico (CAγL) (10 µM); n = 5–10 por grupo. m Trazas medias de KCNQ3* o KCNQ2/3 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia de carnosato de metilo (100 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; protocolo de voltaje como en el panel e; n = 5–10 por grupo. n Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de carnosato de metilo (100 µM); n = 5–10 por grupo. o Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de carnosato de metilo (100 µM); n = 5–10 por grupo. MC metil carnosato. p Estructuras y potenciales superficiales electrostáticos (rojo, negativo; azul, positivo) de derivados del ácido carnósico como se indica. q Acoplamiento in silico de derivados del ácido carnósico al modelo KCNQ3 de tipo salvaje. r Trazas medias de KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 expresadas en ovocitos en ausencia (control) o presencia de derivados del ácido carnósico (10–100 µM). Barras de escala abajo a la izquierda; inserción superior del protocolo de voltaje; n = 10 por grupo. s Corriente de cola normalizada media (G/Gmax) para KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de compuestos como en (r); n = 10 por grupo. t Potencial medio de membrana de ovocitos no fijados para ovocitos que expresan KCNQ2, KCNQ3* o KCNQ2/3 en ausencia (negro) o presencia (rojo) de compuestos como en (r); n = 10 por grupo; CAD Diacetato de ácido carnósico; PA ácido pisiférico. u Media ΔV0.5act para KCNQ3* en respuesta al ácido carnósico y derivados; n = 5–10 por grupo. v Media ΔV0.5act para KCNQ2/3 en respuesta al ácido carnósico y derivados; n = 5–10 por grupo. Respuesta de KCNQ3* al ácido carnósico (gris; de (u)) mostrada a modo de comparación. Las barras de error indican SEM. n indica el número de ovocitos biológicamente independientes. Comparaciones estadísticas mediante ANOVA unidireccional.

A continuación, sintetizamos la γ-lactona de ácido carnósico, que no contiene el grupo carboxilato pero se predice que formará un enlace H con R243 a través de un grupo fenólico en el otro extremo de la molécula (Fig. 10h, i). Curiosamente, la γ-lactona del ácido carnósico fue capaz de hiperpolarizar el V0.5act tanto de KCNQ3* como de KCNQ2/3, aunque muy débilmente (−8,7 y −10 mV, respectivamente) (Fig. 10j, k) y sin hiperpolarizar EM (Fig. . 10l) (tenga en cuenta que debido a problemas de solubilidad solo pudimos probarlo a 10 µM). De manera similar, no se predijo que el carnosato de metilo, en el que reemplazamos el grupo carboxilato de ácido carnósico con un grupo éster metílico (Fig. 10h), formara un enlace iónico con la arginina en KCNQ3 (Fig. 10i), fue solo un activador débil de KCNQ3* y no abrió KCNQ2/3, aunque solo pudimos realizar pruebas a 10 µM debido a su escasa solubilidad (Fig. 10m-o).

Finalmente, nos centramos en los derivados del ácido carnósico que retuvieron el grupo carboxilato del ácido carnósico y su ubicación potencial de superficie electrostática negativa prevista, pero debido a sus estructuras alteradas, también tenían un potencial de superficie electrostático positivo en el extremo opuesto de la molécula al grupo carboxilato. Por lo tanto, el ácido pisiférico tenía una energía libre de unión prevista a las argininas KCNQ3 S4/5 que era muy similar a la del ácido carnósico (-8,1 frente a -8,2 kcal/mol, respectivamente), pero tenía una orientación de unión prevista diferente a la de El ácido carnósico carecía del enlace iónico predicho (Fig. 10p, q) y solo desplazó débilmente negativamente la dependencia del voltaje de KCNQ3* a 100 µM (Fig. 10r-t). El diacetato de ácido carnósico tenía un equilibrio de potencial de superficie electrostático predicho similar al del ácido pisiférico (Fig. 10p), adoptó una orientación de enlace no iónico predicha similar en relación con las argininas KCNQ3 a la del ácido pisiférico (Fig. 10q) y solo débilmente. cambió negativamente la dependencia del voltaje de KCNQ3* o KCNQ2/3 (tenga en cuenta que debido a problemas de solubilidad solo pudimos probarlo a 10 µM) (Fig. 10r-t). En resumen, el ácido carnósico es un compuesto Ricitos de Oro en este espacio químico, con un grupo carboxilato esencial y un equilibrio de carga altamente óptimo para la apertura de KCNQ3* (Fig. 10u, v; Tabla complementaria 10).

El romero es una rica fuente de flavonoles, ácidos fenólicos, terpenoides y aceites esenciales21, y tradicionalmente se ha utilizado con fines medicinales para una amplia variedad de trastornos, que van desde cáncer hasta problemas gastrointestinales y pérdida de memoria, así como un uso generalizado por su sabor en las cocinas de todo el mundo. el mundo17,33. Romero deriva su nombre del latín que significa rocío del mar (ros marinus) porque es originario de los acantilados costeros del Mediterráneo y de Asia; su área de distribución ahora llega hasta América, Inglaterra y el norte de África. El romero fue venerado en la antigua Grecia, Roma, Israel y Egipto por sus supuestos usos beneficiosos contra la pérdida de memoria, el dolor muscular, las infecciones y la disfunción gastrointestinal. Se cree que los romanos lo introdujeron en las Islas Británicas, donde fue utilizado por los druidas celtas para síntomas como dolores de cabeza desde al menos el siglo XIII, y es posible que se cultivara en el sur de Inglaterra incluso antes. Llegaron los romanos17,33.

Hay tantos supuestos usos medicinales del romero que es fácil ser escéptico acerca de su eficacia, pero al menos un subconjunto de efectos terapéuticos ha sido respaldado con estudios preclínicos o clínicos, incluidos beneficios neurológicos en el ámbito de la memoria, la analgesia, la ansiedad y la depresión. , epilepsia, alivio de los síntomas de abstinencia de opio y sueño; y propiedades antimicrobianas, antiinflamatorias y antioxidantes17,34,35. El ácido rosmarínico y el ácido carnósico son los fenólicos del romero más comúnmente asociados con efectos beneficiosos, atribuidos en gran medida a sus acciones antioxidantes y antiinflamatorias34. Anteriormente se descubrió que el extracto de romero y el ácido rosmarínico inhiben el canal de calcio dependiente de voltaje, Cav3.2 (CI50 de ácido rosmarínico 49,9 µM). Los autores sugirieron que la inhibición de Cav3.2 podría contribuir a las propiedades ansiolíticas y neuroprotectoras del romero36. Junto con nuestros nuevos hallazgos, los datos combinados sugieren que el romero puede ser particularmente eficaz como neuroterapéutico debido a los efectos complementarios de dos de sus componentes (ácido rosmarínico y carnósico) sobre las corrientes Cav y Kv, respectivamente. Además, se informó anteriormente que el ácido carnósico disminuye la afinidad de unión del [35S]terc-butilbiciclofosforotionato a las membranas del cerebro de rata in vitro, lo que se considera evidencia de unión a un receptor GABAA, pero no se informaron estudios funcionales37. El ácido carnósico es extremadamente bien tolerado in vivo, con estudios de toxicidad aguda en ratones que indican una LD50 oral de 7,1 g/kg)38.

La eficacia y potencia del ácido carnósico (p. ej., cambio de -25 mV en V0.5 de activación de KCNQ3/5 a 30 µM y EC50 de 4.53 ± 0.11 µM; Tabla complementaria 7) rivalizan con las del ácido carnósico sintético, primero en su clase. Anticonvulsivo de apertura del canal KCNQ, retigabina (ezogabina) (desplazamiento de −31,8 mV en V0.5 de activación de KCNQ3/5 a 30 µM y EC50 de 1,4 µM)20. Donde los dos difieren es que la retigabina, si bien muestra preferencia por KCNQ3, sigue siendo un abridor de canales KCNQ2 y especialmente KCNQ2/3 muy eficaz y, por lo tanto, carece de la isoforma KCNQ y la selectividad del heterómero KCNQ del ácido carnósico39. Esto dota al ácido carnósico de un potencial único como sonda y abridor potencialmente terapéutico de los canales neuronales KCNQ3/5, en comparación con los canales KCNQ2/3, mucho más estudiados y mejor comprendidos.

Recientemente se descubrió que el bactericida triclosán activa KCNQ3 pero no KCNQ2, también hiperpolarizando la dependencia del voltaje de activación, a través de un sitio de unión previsto en la parte superior del sensor de voltaje, similar a lo que encontramos previamente para la quercetina con KCNQ140. Sin embargo, el triclosán también activa los canales KCNQ2/3 (CE50 de 32 µM)40. El triclosán se asocia con diversos riesgos de contaminación ambiental y para la salud, lo que lo hace menos que ideal como posible modulador terapéutico del canal KCNQ41, pero sigue siendo una sonda de corriente M adicional y potencialmente útil. No se han descrito los efectos del triclosán sobre otros homómeros y heterómeros de KCNQ.

Utilizando química medicinal, mutagénesis y acoplamiento in silico, pudimos delimitar varias características de la acción de apertura del KCNQ3* del ácido carnósico. En primer lugar, el ácido carnósico parece casi preoptimizado en este espacio químico, es decir, ninguna de las diversas modificaciones químicas realizadas fue tolerada con respecto a la capacidad de abrir KCNQ3*; Las modificaciones tampoco permitieron abrir sustancialmente KCNQ2 o KCNQ2/3. En segundo lugar, el grupo carboxilato del ácido carnósico parece esencial para una apertura altamente eficaz de KCNQ3*, mediante la formación de enlaces iónicos con el grupo guanidinio de KCNQ3*-R243. En tercer lugar, crear un potencial de superficie electrostático aún más fuerte y más enfocado en una ubicación similar pero usando química reemplazando el grupo carboxilato con un éster (por ejemplo, éster metílico del ácido carnósico) es insuficiente para inducir una apertura robusta de KCNQ3* (Fig. 10). Se podría utilizar más química medicinal para proporcionar un perfil farmacocinético/farmacodinámico preferencial para el desarrollo futuro de fármacos. Cabe señalar que los valores de energía libre de unión (ΔG) previstos, en comparación con los de la unión del ácido carnósico a KCNQ3*, fueron menores para los derivados del ácido carnósico que se unen a KCNQ3* o para la unión del ácido carnósico a KCNQ3*-R242A o KCNA3*-. R243A, pero no dramáticamente más bajo (Fig. 10). Queda por determinar sin ambigüedades si esta reducción prevista en ΔG refleja una reducción en la afinidad de unión suficiente para explicar los efectos funcionales reducidos, versus una reducción moderada en la afinidad de unión junto con una menor capacidad del ácido carnósico unido y sus derivados para activar la apertura del canal con estos mutantes. verificado. Ya se sabe que el ácido carnósico atraviesa la barrera hematoencefálica y es neuroprotector; esta última propiedad se atribuía previamente a la activación de enzimas antioxidantes a través de la vía de transcripción Nrf2; También se ha descubierto que el ácido carnósico protege contra la degeneración de la retina y el estrés oxidativo42. La transcripción y la proteína KCNQ5 se encuentran en el epitelio pigmentario de la retina, donde se cree que contribuye a la corriente M expresada allí43.

Descubrimos que, al igual que la retigabina y el GABA, la apertura del ácido carnósico de KCNQ3* es resistente a la reducción de PIP2, una molécula de señalización derivada de lípidos que acopla la activación del sensor de voltaje con la apertura de canales en los canales KCNQ44. Hay al menos dos interpretaciones de este resultado. La primera es que el ácido carnósico reemplaza o elimina la necesidad de PIP2 y que, independientemente de la presencia de PIP2, el ácido carnósico mantiene su capacidad de apertura. La explicación alternativa es que el ácido carnósico estabiliza la unión de PIP2 al canal, pero aún puede requerir PIP2 para que el ácido carnósico abra KCNQ3, como se sugirió anteriormente para la retigabina22. En este caso, con el tratamiento previo con wortmanina para reducir los niveles de PIP2 antes de la adición de ácido carnósico, la eficacia del ácido carnósico en su KCNQ3* EC50 (5 µM) se redujo en un grado estadísticamente significativo pero moderado, sin respaldar inequívocamente ninguno de los modelos. El ácido carnósico (5 µM) pudo, en promedio, prevenir la caída de corriente de KCNQ3* durante 15 s mediante la activación de DrVSP a +120 mV para agotar PIP2, lo que en ausencia de ácido carnósico resultó en una pérdida de corriente del 50 %. Una vez más, esto no respalda inequívocamente ninguno de los modelos y todavía no tenemos evidencia suficiente para favorecer a ninguno de los dos modelos sobre el otro. Existe un precedente para un modelo de reemplazo de PIP2, es decir, CP1, el reemplazo de PIP2 sintético que contiene sulfato descubierto mediante detección de acoplamiento in silico a KCNQ145. Curiosamente, al igual que PIP2, el ácido carnósico es una molécula anfipática: el ácido carnósico contiene un ácido carboxílico polar y grupos fenol y una estructura de diterpeno no polar. Consideramos probable que su afinidad por KCNQ3 sea función de interacciones iónicas, de enlace de hidrógeno e hidrofóbicas.

Curiosamente, nada en la región de unión KCNQ3 prevista del ácido carnósico da pistas sobre el mecanismo de su selectividad y, inusualmente, el mutante KCNQ3*-W265L es al menos tan sensible como KCNQ3* al ácido carnósico, a diferencia de la retigabina y el GABA. Interpretamos estos hallazgos como evidencia de que el ácido carnósico, como CP1, se une profundamente en el bolsillo de unión entre el poro y la VSD, a diferencia de la retigabina y el GABA, que se unen más cerca de W26526,30,31. A diferencia del CP145, el ácido carnósico no abre el KCNQ1 homomérico. En términos de hiperpolarización V0.5act, CP1 es más activo en KCNQ1/KCNE1, seguido de KCNQ1 y KCNQ3* y luego KCNQ226,30,31 (datos de KCNQ5 no informados); El ácido carnósico es más activo en KCNQ3*, seguido de KCNQ5, con efectos insignificantes en KCNQ1 o KCNQ2. De manera similar a GABA, que encontramos que se une físicamente a KCNQ2–5 (a través del S5 Trp, W265 en KCNQ3 humano) pero solo activa KCNQ3* y KCNQ526, nuestros datos actuales son consistentes con que la selectividad del ácido carnósico es funcional (es decir, la unión abre algunos KCNQ isoformas pero no otras) en lugar de surgir de su capacidad para unirse per se. Se necesitan más estudios para comprender qué imparte esta selectividad funcional.

Curiosamente, se informó anteriormente que, si bien se necesita la presencia de una sola subunidad sensible a la retigabina para una sensibilidad casi máxima a la retigabina, los efectos de ICA73, que se cree que interactúa con el sensor de voltaje KCNQ3*, son altamente sensibles a la mutación de incluso una sola subunidad. subunidad en el tetrámero46. Esta sensibilidad podría ser lo que proporciona una mayor selectividad de isoformas de KCNQ a las moléculas pequeñas dirigidas al dominio del sensor de voltaje en comparación con la retigabina menos selectiva para KCNQ. En cuanto al correlato molecular preciso de esa selectividad, no es necesario que esté en el VSD; Como se analizó anteriormente, si bien la unión puede ocurrir en el VSD, la transducción de esa unión en una activación mejorada podría depender de otros segmentos. La mayor desviación entre KCNQ3 y otras isoformas neuronales se encuentra entre S5 y el filtro de selectividad, donde KCNQ3 contiene diez residuos adicionales, pero también hay diferencias de secuencia esporádicas en todos los segmentos transmembrana, para futuros estudios47.

Es importante señalar que una limitación del estudio es que no verificamos la expresión relativa de la proteína de cada isoforma KCNQ cuando coexpresamos múltiples subunidades. Los ovocitos son superiores a las células de mamíferos para estudios de expresión transitoria de múltiples subunidades, ya que a cada ovocito se le inyecta de forma independiente ARNc para cada subunidad, frente a la transfección de una población de células de mamíferos, lo que es más probable que dé lugar a una mayor variabilidad de la proporción relativa de subunidades en una celda determinada. Sin embargo, es posible que hubiera variabilidad en la expresión relativa de isoformas en un ovocito determinado, y eso puede haber contribuido a una variabilidad modesta en la dependencia del voltaje del punto medio de activación y la tasa de activación entre los grupos de control para una combinación de subunidades determinada. Otras fuentes de variabilidad también podrían ser las fluctuaciones de temperatura o las diferencias en los niveles de PIP2 u otros factores de ovocitos entre diferentes grupos, ya que los registros se realizaron durante muchos meses. No consideramos que esto sea una limitación significativa ya que cada ovocito actúa como su propio control de referencia para comparar las propiedades después de la adición de un extracto o compuesto y, en nuestra experiencia, los cambios de voltaje atribuibles a una molécula pequeña específica y a una isoforma de canal específica son similares a pesar de los cambios modestos. en la dependencia del voltaje del punto medio inicial.

El ácido carnósico abre nuevas vías experimentales y terapéuticas potenciales debido a su combinación única de alta eficacia y selectividad de isoformas, combinada con una potencia micromolar baja que lo coloca en el rango útil para cualquier tipo de aplicación. Desde un punto de vista experimental, tener una molécula pequeña que pueda distinguir fácilmente entre KCNQ3/5 y KCNQ2/3 debería resultar invaluable para delinear el papel de cualquiera de los complejos en tipos de células neuronales y de otro tipo, y con el protocolo de voltaje y dosis correcto, uno podría incluso utilizan ácido carnósico para distinguir KCNQ3/5 de KCNQ2/5 y KCNQ2/3/5; estos dos últimos complejos se han descubierto muy recientemente en cerebro de ratón4. Específicamente, mientras que el ácido carnósico también abre los canales heteroméricos KCNQ2/5 y KCNQ2/3/5, que también se cree que se forman en las neuronas4, si se mantiene la célula a -120 mV, el ácido carnósico es 100% selectivo para KCNQ3/5 sobre los otros canales conocidos. heterómeros neuronales (Fig. 7). Desde un punto de vista terapéutico, a medida que se descubren las diversas funciones de los heterómeros neuronales KCNQ, puede haber oportunidades clínicas para un abridor selectivo KCNQ3/5 que aún no entendemos, tal vez guiados por los usos antiguos del romero como medicina herbaria. Nuestros hallazgos refuerzan aún más el enorme potencial de las plantas para continuar produciendo moléculas pequeñas con actividades novedosas y, junto con esto, la necesidad crítica de reconocer, aprender y preservar las prácticas de la medicina botánica tradicional y los entornos naturales que las sustentan.

Sus hijos recolectaron muestras de Salvia rosmarinus (flores, hojas y partes aéreas enteras) del jardín del autor correspondiente y luego las congelaron hasta el día de la extracción. Homogeneizamos las muestras utilizando un molino de perlas con perlas de porcelana por lotes en tubos de 50 ml (Omni International, Kennesaw, GA, Estados Unidos). Resuspendimos los homogeneizados en 80% de metanol/20% de agua (100 ml por 5 g de sólido) y luego los incubamos durante 48 h a temperatura ambiente, invirtiendo ocasionalmente las botellas para resuspender los extractos. Luego filtramos los extractos a través de papel de filtro Whatman n.° 1 (Whatman, Maidstone, Reino Unido) y luego eliminamos el metanol mediante evaporación en una campana extractora durante 24 a 48 h a temperatura ambiente. Centrifugamos los extractos durante 10 minutos a 15 oC, 4000 RCF para eliminar las partículas restantes, seguido del almacenamiento a -20 oC. El día del registro electrofisiológico, descongelamos los extractos y los diluimos 1:100 en una solución de baño (ver más abajo) inmediatamente antes de su uso.

Generamos transcripciones de ARNc que codifican KCNQ1, 2, 3 y 5 humanos (tipo salvaje y mutante) mediante transcripción in vitro utilizando el kit mMessage mMachine (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, después de la linealización del vector. a partir de ADNc subclonado en vectores de expresión (pTLNx y pXOOM) que incorporan las UTR 5' y 3' de β-globina de Xenopus laevis que flanquean la región codificante para mejorar la traducción y la estabilidad del ARNc. Los ADNc de KCNQ mutantes se generaron mediante Genscript (Piscataway, Nueva Jersey, EE. UU.) y los ARNc se prepararon como se indicó anteriormente. Inyectamos ovocitos defoliculados en estadio V y VI de Xenopus laevis (Xenocito, Dexter, MI, EE. UU.) con ARNc de KCNQ (2 a 10 ng) e incubamos los ovocitos a 16 oC en una solución de almacenamiento de ovocitos ND96 que contiene penicilina y estreptomicina, con lavado diario, para 2 a 4 días antes del registro con pinza de voltaje de dos electrodos (TEVC).

Realizamos TEVC a temperatura ambiente utilizando un amplificador OC-725C (Warner Instruments, Hamden, CT, EE. UU.) y el software pClamp10 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE. UU.) 2 a 4 días después de la inyección de ARNc. Colocamos los ovocitos en un baño de ovocitos de pequeño volumen (Warner) y los observamos con un microscopio de disección para electrofisiología celular. Obtuvimos productos químicos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.) y Combi-Blocks (San Diego, CA, EE. UU.). Estudiamos los efectos de los extractos de Salvia rosmarinus y de los compuestos solubilizados directamente en solución de baño (en mM): 96 NaCl, 4 KCl, 1 MgCl2, 1 CaCl2, 10 HEPES (pH 7,6). Introdujimos extractos o compuestos en el baño de registro de ovocitos mediante perfusión por gravedad a un flujo constante de 1 ml por minuto durante 3 minutos antes del registro. Las pipetas tenían una resistencia de 1-2 MΩ cuando se llenaron con KCl 3 M. Registramos corrientes en respuesta a pulsos de voltaje entre −120 mV y +40 mV a intervalos de 10 mV desde un potencial de retención de −80 mV, para generar relaciones corriente-voltaje y examinar la cinética de activación. Analizamos los datos utilizando Clampfit (Molecular Devices) y el software Graphpad Prism (GraphPad, San Diego, CA, EE. UU.), indicando los valores como media ± SEM. Trazamos las corrientes de cola sin procesar o normalizadas versus el voltaje previo al pulso y las ajustamos con una única función de Boltzmann:

donde g es la conductancia de cola normalizada, A1 es el valor inicial en -∞, A2 es el valor final en +∞, V1/2 es el voltaje de activación semimáximo y Vs el factor de pendiente. Ajustamos la cinética de activación y desactivación con funciones exponenciales únicas.

El ácido carnósico se obtuvo de Combi-Blocks (San Diego, CA.) o Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). El ácido pisiférico se obtuvo de Combi-Blocks. El carnosol estaba disponible comercialmente en Sigma-Aldrich o se preparaba a partir de ácido carnósico utilizando el método de Han et al.48. Se prepararon diacetato de ácido carnósico, carnosato de metilo y γ-lactona de ácido carnósico utilizando el método de Han, et al.48. Conc. El ácido clorhídrico (35-38% en agua) era de Fisher. El metanol (MeOH), el acetato de etilo (EtOAc), el tolueno, el diclorometano (CH2Cl2) y los hexanos fueron de calidad HPLC o LC/MS de Fisher o VWR International. Sigma-Aldrich suministró acetona anhidra. El agua era de 18,2 mΩ-cm de un sistema Barnstead NANOpure DiamondTM. El ácido trifluoroacético se obtuvo de EMD Millipore. Los puntos de fusión (pf) se determinaron en un aparato electrotérmico MEL-TEMP 3.0 (Barnstead International, Dubuque, IA) y no se corrigen.

Las separaciones por HPLC preparativa se llevaron a cabo utilizando un sistema Shimadzu que consta de dos bombas LC-8A, un colector de fracciones (FRC-10A), un muestreador automático SIL-10AP, un detector de matriz de diodos (CPD-M20A) y un módulo de comunicación CBM-20A. . Las separaciones emplearon una columna de fase reversa Waters PREP Nova-Pak® HR C18 6 µM 60 Å 40 × 100 mm con un inserto Guard-Pak de 40 × 10 mm y una base universal Waters PrepLC. El sistema disolvente empleado fueron gradientes de MeOH/agua que contenían ambos 0,1 % de TFA. Se recogieron fracciones en función de su respuesta a 254 nm. La cromatografía ultrarrápida se llevó a cabo en gel de sílice de malla 230–400 (gel de sílice 60, Geduran) obtenido de Fisher Scientific utilizando el método de Still et al.49. Las columnas se eluyeron con mezclas de EtOAc/hexanos o CH2Cl2. La cromatografía en capa fina (TLC) empleó placas de gel de sílice Analtech GHLF UV254 UniplateTM de Miles Scientific. Las placas se visualizaron bajo luz ultravioleta o con vapor de I2.

La espectroscopia de masas empleó un espectrómetro de masas cuadrupolo de triple etapa Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra. La ionización por electropulverización calentada (H-ESI) se utilizó en modo de ionización negativa o positiva dependiendo de la estructura del analito. Se utilizaron métodos automáticos para la optimización de los parámetros del instrumento para maximizar la sensibilidad. Las muestras se analizaron mediante inyección directa en MeOH o MeOH/agua (la concentración de TFA se mantuvo al 0,01 % o menos) usando una bomba de jeringa.

Para la síntesis de diacetato de ácido carnósico, se trató ácido carnósico (1,02 g, 3,05 mmol) en CH2Cl2 (13 ml) con anhídrido acético puro (1,6 ml) y 4-dimetilaminopiridina (DMAP, 443 mg). La reacción se calentó después de añadir DMAP. La solución amarilla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. Luego la reacción se diluyó con CHCl3 (40 ml) y se extrajo con una solución acuosa 1 M. Solución de HCl (25 ml). La capa orgánica se separó y se lavó con salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta sequedad. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida con un gradiente de hexanos/EtOAc de 4:1 a 3:1. El producto se aisló como un aceite (480 mg) que solidificó al reposar. El sólido resultante tenía un pf de 94 a 95 oC (pf iluminado de 158 a 159 oC50. EM ESI- m/z 415 (M – H+).

Para la síntesis de carnosato de metilo, se disolvió ácido carnósico (329 mg, 0,99 mmol) en tolueno/MeOH (6 ml) 5:1 en atmósfera de N2 y se enfrió en un baño de agua con hielo. La reacción se trató con una solución de 1,8 a 2,4 M de TMSCN2 en hexanos (Thermo-Fisher; 1,1 ml) añadida gota a gota mediante una jeringa. La reacción se agitó en frío y luego se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La reacción se enfrió en un baño de agua con hielo y una solución acuosa de 2 M. Se añadió solución de HOAc (10 ml). La mezcla de dos fases se repartió entre agua y EtOAc. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró. al vacío. La cromatografía ultrarrápida con hexanos/EtOAc 9:1 dio 191 mg del éster metílico como un sólido blanco con pf que se ablanda a 118 oC, funde entre 126 y 127 oC (encendido, p.f. 118 a 119 oC51. MS ESI- m/z 345 (M – H+).

Para la síntesis de γ-lactona de ácido carnósico, se trató ácido carnósico (125 mg, 0,30 mmol) en 3 ml de CH2Cl2 con DCC sólido (86 mg). Se formó una ppt casi de inmediato. Luego se añadió DMAP vendido (7,7 mg). La mezcla se agitó a temperatura ambiente en una atmósfera de N2 durante 5 hy luego se filtró. Las aguas madres se concentraron hasta sequedad y se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida (CH2Cl2 al 100%). La lactona (40 mg) se aisló en forma de una espuma amarilla. El punto de fusión iluminado para la lactona es 106–109 oC52. MS ESI- m/z 313 (M – H+).

El dimetil éter de carnosol se preparó utilizando el método de Luis et al. (Luis, JG et al.53. excepto que el compuesto se purificó mediante HPLC de fase inversa.

Para la síntesis de di-d3-metilcarnosol, se trató carnosol (100 mg, 0,30 mmol) en acetona (16 ml) en un baño de agua helada con d3-MeI puro (500 µl, 1,16 g, 8,00 mmol) y 2 eq. de K2CO3 (84 mg, 0,60 mmol). La mezcla resultante se agitó en frío y luego se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La reacción se diluyó con agua fría y se extrajo con EtOAc (3 x 40 ml). La capa orgánica reunida (amarilla) se lavó con salmuera, se secó (MgSO4), se filtró y se concentró hasta sequedad, tara 130,835 g, peso 138 mg. El producto bruto se purificó mediante RPHPLC (20 a 100 % de MeOH/agua que contenía 0,1 % de TFA). Se recogieron las fracciones con temperatura ambiente de 6,6 min y se concentraron hasta 13 mg de di-d3-metilcarnosol en forma de un aceite; encendido pf 155–157 oC50. EM (ESI+) m/z 365 (M + H+) y 387 (M + Na+).

Trazamos y visualizamos estructuras químicas y potencial de superficie electrostática utilizando Jmol, un visor Java de código abierto para estructuras químicas en 3D: http://jmol.org/. Para las predicciones de acoplamiento de ligandos in silico de la interacción con canales KCNQ, realizamos un acoplamiento no guiado para predecir sitios de interacción potenciales, utilizando SwissDock con campos de fuerza CHARMM54,55, la estructura KCNQ2 derivada de crio-EM (PDB: 7CR0)27, AlphaFold28,29- estructura del modelo KCNQ3 predicha (archivo de estructura suplementaria 1) y la estructura del modelo neuronal KCNQ (KCNQ5) (archivo de estructura suplementaria 2) 15.

Todos los valores se expresan como media ± SEM. Se realizaron estadísticas de comparación múltiple utilizando un ANOVA unidireccional con un Tukey HSD post-hoc. La comparación de dos grupos se realizó mediante una prueba t; todos los valores de p fueron bilaterales. Los datos electrofisiológicos se confirmaron en al menos dos lotes de ovocitos. Las réplicas biológicas se definen como el número de ovocitos; Los tamaños de muestra se dan en las leyendas de las figuras.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de origen de las Figs. 1–10 están disponibles en el repositorio de datos de Dryad: https://doi.org/10.7280/D1GH5Q.

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Este estudio fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NS107671) para GWA y el Instituto de Salud Integrativa Susan Samueli, Beca Samueli para GWA. Agradecemos al Dr. Ryan Yoshimura por su asistencia técnica y asesoramiento, a George Abbott y Victoria Abbott por recolectar muestras de Salvia rosmarinus, y a Bo Abbott por las imágenes de Salvia rosmarinus.

Laboratorio de Bioelectricidad, Departamento de Fisiología y Biofísica, Facultad de Medicina, Universidad de California, Irvine, CA, EE. UU.

Rían W. Manville, Derk Hogenkamp y Geoffrey W. Abbott

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GWA y RWM concibieron el estudio; RWM realizó análisis TEVC y analizó datos; DH conceptualizó, sintetizó y analizó productos químicos, GWA supervisó y obtuvo financiación para el proyecto; RWM, DH y GWA prepararon las figuras, GWA escribió el manuscrito; Todos los autores editaron el manuscrito.

Correspondencia a Geoffrey W. Abbott.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Jerome Lacroix y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Yun Luo y Joao Valente. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Manville, RW, Hogenkamp, ​​D. & Abbott, GW La antigua planta medicinal de romero contiene un abridor de canales de potasio KCNQ altamente eficaz y selectivo de isoformas. Común Biol 6, 644 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05021-8

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Recibido: 17 de enero de 2023

Aceptado: 06 de junio de 2023

Publicado: 15 de junio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05021-8

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