Actividad antiviral de compuestos fenólicos naturales en complejo en un sitio alostérico del SARS

Jun 13, 2023

Biología de las comunicaciones volumen 5, número de artículo: 805 (2022) Citar este artículo

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La proteasa similar a la papaína (PLpro) del SARS-CoV-2 cubre múltiples funciones. Además de la actividad de cisteína-proteasa, que facilita la escisión de la cadena polipeptídica viral, PLpro tiene la función adicional y vital de eliminar la ubiquitina y el ISG15 (gen 15 estimulado por interferón) de las proteínas de la célula huésped para ayudar a los coronavirus a evadir las respuestas inmunes innatas del huésped. Identificamos tres compuestos fenólicos unidos a PLpro, evitando interacciones moleculares esenciales con ISG15 mediante la selección de una biblioteca de compuestos naturales. Los compuestos identificados mediante detección con rayos X y formando complejos con PLpro demuestran una clara inhibición de PLpro en un ensayo de actividad de deISGilación. Dos compuestos exhiben una actividad antiviral distinta en ensayos de líneas celulares Vero y uno inhibió un efecto citopático en rangos de concentración no citotóxicos. En el contexto del aumento de las mutaciones de PLpro en las nuevas variantes en evolución del SARS-CoV-2, los compuestos naturales que identificamos también pueden restablecer los procesos de respuesta inmune antiviral del huésped que están regulados negativamente en las infecciones por COVID-19.

La enfermedad por coronavirus COVID-19, causada por el SARS-CoV-2, sigue siendo devastadora con un elevado número de infecciones y muertes1. En sólo un año se desarrollaron en todo el mundo varias vacunas aprobadas y altamente eficaces contra la COVID-19. Sin embargo, estas vacunas no están disponibles de manera uniforme en todo el mundo y, en consecuencia, ya han surgido nuevas variantes del SARS-CoV-2 que pueden afectar la eficacia de las vacunas disponibles en el futuro2. Paralelamente, se necesitan más esfuerzos para identificar y optimizar tratamientos alternativos para los pacientes infectados por SARS-CoV-2, que no responden a las vacunas o no las toleran3. Por lo tanto, se están realizando investigaciones a un ritmo rápido para identificar candidatos a fármacos eficaces mediante la aplicación de estrategias complementarias. Un enfoque que seguimos recientemente es la detección cristalográfica masiva de rayos X para detectar inhibidores de la proteasa principal Mpro del SARS-CoV-2, una proteína esencial en el proceso de replicación viral y, por lo tanto, un importante objetivo farmacológico4. Identificamos seis compuestos que inhiben Mpro que mostraron actividad antiviral y estos compuestos se están acercando actualmente al paso de investigaciones preclínicas4.

El genoma de ARN monocatenario de sentido positivo de los coronavirus codifica 16 poliproteínas no estructurales (nsps 1-16). La proteasa similar a la papaína (PLpro) es un dominio que forma parte del gen nsp3, la proteína madura más grande del SARS-CoV-25. Se requiere PLpro para reconocer y escindir el motivo LXGG dentro de las poliproteínas preprocesadas entre nsp1/2, nsp2/3 y nsp3/4 en unidades funcionales para el inicio, la replicación y la transcripción del genoma viral6,7. Además de la actividad proteolítica, PLpro también puede unirse y escindir cadenas de ubiquitina o ISG15 (producto génico 15 estimulado por interferón) de proteínas ubiquitinadas o ISGiladas8. La deubiquitinasa (DUB), así como las actividades deISGilantes, son vitales para que los coronavirus antagonicen las respuestas inmunitarias del huésped. Se ha demostrado que la monoubiquitinación en las membranas del retículo endoplásmico (RE) regula la endocitosis y el tráfico de vesículas y, por tanto, es importante para la propagación del coronavirus9. Por otro lado, ISG15 provoca modificaciones en la vía metabólica hacia respuestas inflamatorias y autoinmunes excesivas debido a desregulaciones del sistema de interferón10,11. Las proteínas diana del coronavirus, como el IRF3 (factor regulador de interferón 3), deben conjugarse con ISG15 para fosforilarse correctamente para su entrada al núcleo, donde son necesarias para eventos de señalización posteriores, por ejemplo, a través de la vía IFN-β12 para provocar un antiviral. respuesta inmune. Por lo tanto, la actividad cisteína proteasa, junto con la deubiquitinasa y la actividad deISGilación de PLpro, sin duda hacen de esta enzima un objetivo muy prometedor para las investigaciones de descubrimiento de fármacos13,14. Además, la importancia de PLpro como diana farmacológica se destacó en varios estudios recientes13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 que han identificado mutaciones novedosas e inesperadas en el dominio PLpro del gen nsp3 de las variantes preocupantes (VOC) del SARS-CoV-2, que actualmente circulan en diferentes partes del mundo23,24.

La estructura cristalina del SARS-CoV PLpro, en complejo con la diubiquitina25 unida a Lys48 (código PDB 5E6J), evoca claramente un mecanismo de acción del DUB en el que los residuos de LXGG en el extremo C-terminal de la molécula de ubiquitina se unen en una hendidura ( Sitio de unión proximal Ub S1) ubicado cerca del sitio activo catalítico, lo que permite una escisión eficiente. Además, la estructura cristalina obtenida recientemente de SARS-CoV-2 PLpro, en complejo con ratón-ISG1526, demuestra que la región N-terminal de ISG15 interactúa con PLpro en un sitio de unión denominado sitio de unión distal ISG15/Ub S2. En comparación con la estructura cristalina de ISG15 (código PDB 5TLA), la parte N-terminal de la molécula ISG15 en la estructura compleja de SARS-CoV-2 PLpro gira aproximadamente 90° y se coordina con la hélice S2. Estos diferentes eventos de unión explican y resaltan por qué SARS-CoV-2 PLpro y SARS-CoV PLpro, a pesar de compartir un 83% de identidad de secuencia, muestran diferentes preferencias de sustrato. Recientemente se publicaron datos que muestran una mayor afinidad y especificidad del SARS-CoV-2 PLpro por el ISG15, mientras que el SARS-CoV PLpro escinde preferentemente las cadenas de ubiquitina, lo que puede estar asociado con una morbilidad y mortalidad sustancialmente mayores del SARS-CoV-2 en comparación con el SARS. -Infecciones por CoV27.

Hasta ahora se iniciaron varias actividades de detección de ensayos de alto rendimiento (HTS), centradas en identificar inhibidores potenciales de PLpro utilizando bibliotecas de compuestos reutilizados. Desafortunadamente, estos no tuvieron mucho éxito en la obtención de compuestos que pudieran desarrollarse aún más para obtener un fármaco antiviral eficaz27. Por lo tanto, establecimos una estrategia diferente para explorar una biblioteca única que consta de 500 compuestos naturales ensamblados y caracterizados por el Banco Molecular, ICCBS, Karachi, Pakistán, mediante diseño de fármacos basado en estructura (https://iccs.edu/page-mol -banco). Los compuestos naturales del Banco Molecular ICCBS extraídos de plantas presentan características tales como una alta diversidad química, acción antitumoral, antioxidante, antiinflamatoria y, sobre todo, antiviral médicamente relevante, con efectos secundarios típicamente más leves o nulos, además de un menor costo de producción. en comparación con la mayoría de los medicamentos disponibles en el mercado28. Varios de estos compuestos también tienen una larga historia de uso como moléculas farmacológicas para tratar distintas enfermedades humanas, incluidas infecciones virales, como la infección por el virus de la hepatitis C29. Informes recientes también demuestran el uso potencial de moléculas vegetales y sus metabolitos secundarios contra el SARS-CoV-2 y otros coronavirus humanos30,31,32 mediante la aplicación de enfoques in vitro e in silico. Sin embargo, hasta donde sabemos, hasta la fecha no estaba disponible una selección sistemática de productos naturales mediante el descubrimiento de fármacos basado en la estructura que proporcione datos experimentales directos sobre la formación de complejos.

Nuestro cribado de alto rendimiento mediante cristalografía de rayos X identificó tres compuestos naturales unidos a PLpro. Los tres compuestos, 4-(2-hidroxietil)fenol (YRL), 4-hidroxibenzaldehído (HBA) y 3,4-dihidroxibenzoato de metilo (HE9) son derivados del fenol, clasificados como polifenoles, una clase importante y principal de compuestos bioactivos presentes. en plantas. Este vasto grupo de compuestos bioactivos se divide en cinco clases principales: ácidos hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, flavonoides, estilbenos y lignanos. Además de las conocidas actividades antioxidantes y antiinflamatorias de los derivados del fenol, varios estudios han informado de su potencial antiviral contra el virus de Epstein-Barr33,34, el enterovirus 7135, el virus del herpes simple (HSV)36, el virus de la influenza37, y otros virus que causan infecciones relacionadas con las vías respiratorias38.

Curiosamente, los tres compuestos YRL, HBA y HE9 se unen al mismo sitio de unión alostérico ISG15/Ub-S2, aún inexplorado, en la región del pulgar de PLpro formando interacciones específicas e inhiben claramente PLpro en ensayos de actividad de deISGilación. Ninguno de estos compuestos principales es citotóxico en los ensayos de citotoxicidad celular y, por lo tanto, podrían ser compuestos principales prometedores con potencial para desarrollarse como inhibidores coronavirales específicos de PLpro. Significativamente, dos de ellos exhiben actividad antiviral y uno inhibe los efectos citopáticos en el rango del 60 al 80% en un rango de concentración no citotóxica de hasta 100 µM en ensayos celulares. Sin duda, estos tres compuestos fenólicos naturales proporcionan un andamiaje como fármacos antivirales para un mayor desarrollo y optimización hacia la prevención y/o reducción de la replicación viral del SARS-CoV-2, y para restablecer y apoyar la respuesta inmune innata del huésped en paralelo.

Iniciamos un enfoque de descubrimiento de fármacos basado en estructuras para identificar inhibidores potenciales de PLpro mediante detección con rayos X de 500 compuestos del Banco Molecular ICCBS. El SARS-CoV-2 PLpro se expresó de forma recombinante en Escherichia coli y se purificó hasta obtener homogeneidad como monómero (ver Métodos). Se obtuvieron cristales de enzimas de tipo salvaje en condiciones estables y reproducibles y difractaron rayos X a una alta resolución de 1,42 Å. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla 1. Los mapas de densidad electrónica obtenidos para la enzima de tipo salvaje permitieron dilucidar los 315 residuos de aminoácidos, el ion zinc y 529 moléculas de agua solvente. Además, en el mapa de densidad electrónica se podría modelar una molécula de glicerol del crioprotector, utilizado para congelar cristales, así como un ion fosfato y dos iones cloruro.

PLpro se pliega con una arquitectura diestra que consta de dominios de pulgar, palma y dedos con una tríada catalítica que consta de Cys111-His272-Asp286 y un dominio similar a ubiquitina N-terminal (Fig. 1). Cuatro cadenas laterales de cisteína coordinan un ion zinc, constituyendo un "motivo de dedo de zinc" que es esencial para la estabilidad estructural y la actividad proteasa de la enzima39. La estructura general de SARS-CoV-2 PLpro es homóloga a SARS-CoV PLpro (código PDB 2FE8) que comparte una identidad de secuencia del 83% con un rmsd de 0,58 Å para 260 átomos de Cα equivalentes y también a MERS-CoV PLpro (PDB código 4RNA) a pesar de una identidad de secuencia más baja del 29% y un rmsd correspondiente de 1,83 Å para 258 átomos de Cα equivalentes (Figs. S4 y S8). Las regiones estructuralmente más dinámicas son los dominios tipo pliegue de ubiquitina y dedos de zinc. La región del sitio catalítico activo está conformacionalmente bien conservada entre las diferentes enzimas PLpro coronavirales. El acceso al sitio activo se regula a través de un bucle flexible llamado "bucle de bloqueo 2" (BL2, Fig. 1), ya que este bucle cambia de una conformación "abierta" a una "cerrada" en el contexto de la unión del sustrato40. Varios inhibidores de PLpro conocidos se unen a este sitio, incluido el inhibidor de alta afinidad GRL0617, y se han observado variaciones estructurales en este bucle entre diferentes enzimas PLpro41.

Los dominios PLpro se representan en una arquitectura para diestros, con forma de ubiquitina (azul), pulgar (verde), palma (rosa salmón) y dedos (naranja claro). Los residuos del sitio catalítico activo Cys 111, His 272 y Asp 286 se representan como barras y un ion zinc en el dominio de los dedos se muestra como una esfera gris. El bucle de bloqueo flexible (bucle BL2) que cambia la conformación en el contexto de la unión del sustrato se muestra en azul. Los compuestos YRL (esferas verdes), HBA (esferas amarillas) y HE9 (esferas rosas) se unen en el sitio alostérico que se encuentra a una distancia de aproximadamente 30 Å del sitio activo. Se indica la hélice S2 implicada en la interacción de la molécula ISG15. El recuadro muestra una vista ampliada de los dos compuestos HBA e YRL en el sitio de unión.

Los cristales de SARS-CoV-2 PLpro, en complejo con los tres compuestos naturales, se obtuvieron mediante cocristalización utilizando el método de difusión de vapor en un enfoque de detección que utiliza 500 moléculas de una biblioteca de compuestos naturales. Los cristales se cultivaron en las mismas condiciones que para el PLpro nativo y se recolectaron conjuntos de datos de difracción en el rango de resolución de 1,7 a 1,9 Å. Se recolectaron más de 2000 cristales y se recopilaron múltiples conjuntos de datos para cada compuesto que dieron como resultado ~2500 conjuntos de datos de difracción (Fig. S12). Las estructuras de PLpro complejadas con compuestos inhibidores se resolvieron utilizando el PLpro libre de ligando (código PDB 7NFV) como modelo de referencia para la indexación consistente de conjuntos de datos con una canalización automática previamente establecida (ver Métodos). Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla 1. Las tres estructuras complejas obtenidas se superponen bien con la estructura libre de ligando 7NFV con un rmsd de 0,26 Å (298 átomos de Cα) a 7OFS, un rmsd de 0,07 Å (283 átomos de Cα) a 7OFU y rmsd de 0,33 Å (299 átomos de Cα) a 7OFT, respectivamente. Los tres compuestos se unen al sitio alostérico ISG15/Ub S2, cerca de la región del pulgar de PLpro (Fig. 1), que se encuentra a aproximadamente 30 Å del residuo del sitio activo Cys 111. La interacción entre estos inhibidores alostéricos y PLpro se forma a través de enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y de apilamiento π (Figs. S5, S6 y S7).

El compuesto natural 4-(2-hidroxietil)fenol (YRL), aislado de Lawsonia alba, es un conocido antioxidante y agente antiarritmia (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/2 -_4-Hidroxifenil_etanol). YRL se une a PLpro en el sitio de unión alostérico ISG15/Ub S2 en una cavidad hidrófoba con una energía de unión prevista de −7,17 kcal/mol (calculada con Prodigy42). El núcleo de benceno está cubierto por interacciones hidrófobas con cadenas laterales de Val 11, Val 57, Pro 59, Tyr 72 y Leu 80. El átomo de nitrógeno de la cadena principal de Leu 80 está unido por puente de hidrógeno a través de una molécula de agua al sustituyente hidroxietilo de YRL. . Curiosamente, el sustituyente hidroxietilo se observa con dos conformaciones alternativas y se refina para igualar la ocupación en la estructura compleja. Una conformación forma un enlace de hidrógeno con el esqueleto carbonilo de Asp 76, el hidroxilo alternativo al carbonilo de Thr 74. Ambos grupos hidroxilo alternativos reemplazan las moléculas de agua en la enzima libre de ligando y tienen contactos con las moléculas de agua del solvente en la entrada del bolsillo de unión. . El hidroxilo fenólico está unido por enlaces de hidrógeno al oxígeno carbonilo de Val 57 en la parte inferior del bolsillo de unión para completar la interacción del ligando YRL en la estructura del complejo PLpro-YRL (Fig. S5).

El segundo compuesto, el 4-hidroxibenzaldehído (HBA), aislado de la torta de Acalypha, es un conocido agente antitumoral43,44. La energía de unión calculada para la interacción del ligando HBA con PLpro es −6,97 kcal/mol. El núcleo de benceno y el hidroxilo fenólico se observan en la misma posición y, por lo tanto, tienen una interacción similar con PLpro como se describió anteriormente para YRL (Fig. S6). La distancia del hidroxilo fenólico de ambos compuestos al Cα de Val 11 indica un enlace de hidrógeno CH···O (3,4 Å). El sustituyente aldehído tiene contactos débiles con el agua en la entrada de la bolsa de unión. El cambio estructural notable en PLpro para acomodar estos dos compuestos es que la cadena lateral de Leu 80 tiene que inclinarse hacia afuera en las estructuras complejas de PLpro (Fig. S13).

El tercer compuesto, el 3,4-dihidroxibenzoato de metilo (HE9), aislado de Tagetes patula (caléndula), es un difenol importante que se encuentra en el té verde con efectos antioxidantes y antiinflamatorios45 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih. gov/compuesto/metil-3_4-dihidroxibenzoato). La energía de enlace calculada para esta interacción es −6,15 kcal/mol. HE9 se une a la superficie de PLpro adyacente a la cavidad de unión con ligandos HBA e YRL. La interacción con PLpro se forma mediante enlaces de hidrógeno del borde del dihidroxifenol con la cadena lateral de Glu 70. Se observan interacciones hidrofóbicas que incluyen el apilamiento π con el imidazol de His 73 y los contactos del núcleo de benceno con la cadena lateral de Phe69 (Fig. .S7). La extracción, aislamiento y purificación de los tres compuestos HBA, YRL y HE9 se presentan en las notas complementarias 1, 2 y 3. Los espectros de RMN de HBA, YRL y HE9 se muestran en las figuras complementarias. S1, S2 y S3 respectivamente.

Determinamos las constantes de unión para los ligandos HBA y HE9 utilizando su efecto de extinción sobre la fluorescencia para PLpro aplicando el método nanoDSF (nano fluorimetría de barrido diferencial)46. Esto resultó en valores de Kd de ~ 400 μM para HBA y 1 mM para HE9 (dependiendo de la longitud de onda de emisión utilizada, Fig. S15). YRL mostró una alta intensidad de fluorescencia intrínseca y, por lo tanto, no pudo usarse en un experimento de titulación de fluorescencia. Dado que YRL es estructuralmente muy homólogo a HBA y se une en el mismo bolsillo de PLpro, asumimos una afinidad de unión similar.

Las redes de interacción descritas de los tres compuestos involucran residuos de aminoácidos Phe 69, Glu 70 y His 73 que previamente se ha demostrado que interactúan con las moléculas ISG15 y Lys48di-Ub25,26. Las estructuras cristalinas de SARS-CoV PLpro, en complejo con Lys48di-Ub (5E6J), y SARS-CoV-2 PLpro en complejo con ratón-ISG15 (6YVA), respaldadas por simulaciones de dinámica molecular, revelan claramente las interacciones hidrofóbicas entre estos residuos de aminoácidos en PLpro con moléculas ISG15 o Lys48-di ubiquitina26. Una superposición de las estructuras del complejo PLpro + inhibidor con el complejo PLpro + ISG15 (Fig. 2a) muestra que la unión de los compuestos naturales claramente interrumpe y previene la unión de ISG15 a PLpro. Los residuos críticos Ser 22, Met 23 y Glu 27 ubicados en la superficie de unión de ISG15 ya no están disponibles para formar interacciones con PLpro (Fig. 2b) tras la unión de estos productos naturales.

a Superposición de las estructuras cristalinas del SARS-CoV-2 PLpro-C111S en complejo con ratón-ISG15 (código PDB 6YVA, molécula ISG15 en azul) con SARS-CoV-2 PLpro+HE9 (código PDB 7OFU, en representación de superficie gris) . Los tres compuestos YRL, HBA y HE9 se representan como esferas. b Vista de primer plano del sitio de unión ISG15. La molécula ISG15 se muestra como una representación de dibujos animados (azul) con los residuos que interactúan Ser 22, Met 23 y Glu 27 en barras. Los compuestos inhibidores unidos (esferas) impiden claramente la unión de la molécula ISG15 al sitio de unión S2 de PLpro.

Las enzimas PLpro comparten el mismo residuo central, SARS-CoV Phe 70 y SARS-CoV-2 Phe 69 en el sitio de unión ISG15. Una mutación de este residuo en PLpro a alanina disminuyó la actividad enzimática y también resultó en una reacción más lenta con ISG15, en comparación con la enzima de tipo salvaje26. En MERS-CoV PLpro, Phe 69 se reemplaza por un residuo de lisina (F69K) y His 73 por un residuo de glicina (H73G). Estas variaciones podrían explicar las diferentes preferencias de sustrato entre el SARS-CoV, el SARS-CoV-2 y el MERS PLpro. Se puede observar a partir de una superposición de la estructura cristalina del MERS-CoV PLpro+ISG15 (6BI8), con la estructura compleja del SARS-CoV-2 PLpro-HE9 (7OFU), que las sustituciones F69K y H73G confieren diferentes propiedades superficiales para el interacción con ISG15 (Fig. S10a, b).

La escisión de las cadenas de poliubiquitina por el SARS-CoV-2 PLpro mejora significativamente cuando se utiliza una cadena de ubiquitina más larga. Esto demuestra que las moléculas Ub o ISG15 se unen no solo al sitio de unión Ub-S1 sino también al sitio Ub-S2, facilitado por la hélice S2 conservada en PLpro, siendo importante para la actividad enzimática47. La superposición de estructuras cristalinas de PLpro en complejo con diubiquitina unida a Lys48 (5E6J) con el complejo PLpro-HE9 (7OFU) mostró que los residuos clave involucrados en la ubiquitinación, Lys 11 y Lys 48 en el sitio de unión S2-Ub, ya no están disponible para unirse a ubiquitina o ISG15 (Fig. S9 a, b). Por lo tanto, surge una base molecular clara para la inhibición de las tres estructuras del complejo inhibidor de PLpro, lo que muestra que las interacciones PLpro-ISG15 se ven afectadas por la unión de los tres productos fenólicos naturales.

Se llevaron a cabo ensayos de actividad de fluorescencia para evaluar el efecto inhibidor de los tres compuestos (HE9, YRL y HBA), cocristalizados con el SARS-CoV-2 PLpro de tipo salvaje. Se usó un mutante PLpro catalíticamente inactivo (C111S) como control aplicando ISG15-Rodamina y Ub-Rodamina como sustratos. El PLpro de tipo salvaje (WT PLpro) a una concentración de 10 nM representa el 100% de la actividad de deISGilación y los tres compuestos naturales YRL, HBA y HE9 a 50 µM muestran una clara inhibición de la actividad enzimática de PLpro utilizando ISG15-rodamina como sustrato. En particular, los dos compuestos, HBA y YRL, redujeron significativamente la actividad de PLpro en ~73 y 70% respectivamente, seguidos de la inhibición de HE9 a ~55% en un ensayo de deISGilación (Fig. S11); mientras que la inhibición no fue tan pronunciada al aplicar Ub-Rodamina como sustrato (Fig. S16). Se puede racionalizar que la unión de los compuestos naturales en la región de la hélice S2 previene claramente las interacciones moleculares esenciales de PLpro/ISG15 requeridas para el mecanismo de deISGilación de PLpro.

Además, determinamos la eficacia de la inhibición realizando ensayos de IC50 in vitro, que demostraron una inhibición eficiente de los tres compuestos, a saber, HE9 (3,4-dihidroxibenzoato de metilo), HBA (p-hidroxibenzaldehído) y YRL (4-(2-hidroxietil)fenol. ), en un rango de concentración de 3,76 ± 1,13, 3,99 ± 1,33 y 6,68 ± 1,20 μM respectivamente. El compuesto, GRL0617 (5-Amino-2-metil-N-[(1R)-1-(1-naftalenil) etil] benzamida), un inhibidor conocido de PLpro, se utilizó como control (Fig. 3a). Para caracterizar la especificidad de los tres compuestos hacia PLpro, también se realizaron ensayos de inhibición enzimática con la proteasa principal del SARS CoV-2 (Mpro) y la aplicación de los tres compuestos, considerando el mismo protocolo de PLpro con tiempo de incubación de hasta 6 h. Los resultados demostraron claramente que no hay efecto inhibidor de la actividad de Mpro en presencia de los tres compuestos naturales en comparación con el conocido inhibidor de Mpro GC-376, como se muestra en la Fig. S14. Las actividades antivirales para estos compuestos fenólicos naturales, ya sea en forma cruda o purificada, se informaron anteriormente35,38 y ahora pueden relacionarse con la inhibición de PLpro, como se muestra en nuestros ensayos de actividad. Sin embargo, no podemos excluir la interacción de estos compuestos con otras proteínas diana celulares vitales. Además, recientemente se ha demostrado que el dominio mínimo PLpro es incapaz de escindir la proteína de fusión Nsp1/2 y se ha demostrado que se requiere la proteína central Nsp3 de longitud completa para representar la actividad peptidasa PLpro, lo cual debe considerarse en términos de las investigaciones de descubrimiento de fármacos48.

Se realizó una determinación de IC50 con ISG15-rodamina como sustrato a una concentración de 250 nM. En la mezcla de reacción se usó un gradiente de concentración de los tres compuestos YRL, HBA, HE9 y el inhibidor GRL-0617 como control en el intervalo de 2 a 50 µM. Los valores de CI50 se calcularon ajustando los datos a una función sigmoidea de dosis-respuesta-inhibición y se presentan en la escala logarítmica para la interpolación. Los puntos de datos individuales representan la media de la unidad de fluorescencia relativa normalizada por minuto ± DE de triplicados. b Resumen de los perfiles de inhibición de los tres compuestos naturales YRL, HBA, HE9 y el compuesto de control GRL-0617 (TTT) obtenidos a partir de ensayos de actividad enzimática y ensayos antivirales de líneas celulares.

Teniendo en cuenta el efecto sinérgico inhibidor observado, combinado con la función de homeostasis antiviral reguladora molecular de ISG15 en el huésped humano, investigamos la eficacia inhibidora de los compuestos HE9, HBA e YRL hacia la replicación viral y el efecto citopático en células vivas utilizando la línea celular Vero. ensayos. Se aplicaron dos enfoques distintos, la reacción qRT-PCR como se describió anteriormente4,25 y el ensayo CellTiter-Glo, un ensayo indicador de luciferasa para determinar el nivel de ATP presente en células viables49. Los experimentos de detección comenzaron con 5 mM de los tres compuestos y utilizaron una serie de diluciones 1:10 de 10 puntos, realizándose infecciones con un valor de multiplicidad de infección (MOI) de 0,01. Los dos compuestos HE9 e YRL mostraron una reducción de la replicación del ARN viral (ARNv) con valores de CI50 de 0,13 y 1 µM respectivamente, sin toxicidad celular asociada a 100 µM (Fig. 4a). Los experimentos de viabilidad celular se realizaron simultáneamente en las mismas condiciones en ausencia de virus y no revelaron efectos sobre la viabilidad celular en concentraciones en las que los compuestos mostraban actividad antiviral (Fig. 4b).

a El título viral y la viabilidad celular se cuantificaron mediante qRT-PCR (●) y el método de luminiscencia CellTiter-Glo (■), respectivamente. Se muestran los valores de IC50 y R cuadrado para títulos virales. Los valores de IC50 se calcularon ajustando los datos a la función sigmoidal como se describió anteriormente4. Las concentraciones de compuestos se presentan en escala logarítmica para interpolación. HE9 se diluyó hasta una concentración madre de 100 mM en DMSO, mientras que YRL se diluyó en agua esterilizada hasta una concentración madre de 50 mM. Todos los compuestos se almacenaron a -20 °C. Los puntos de datos individuales representan medias ± DE de cuatro réplicas independientes en dos experimentos biológicos. Los valores se representaron en un gráfico de líneas con barras de error que muestran la desviación estándar. b La viabilidad celular en presencia de los tres compuestos se determinó mediante el método de luminiscencia CellTiter-Glo. Puntos de datos individuales de tres réplicas independientes en tres experimentos biológicos. c La inhibición de CPE se determinó mediante el método de luminiscencia CellTiter-Glo. Se muestran los valores de IC50 y R cuadrado. Los valores de IC50 se calcularon ajustando los datos a la función sigmoidal. Los puntos de datos individuales representan medias ± DE de tres réplicas independientes en un experimento biológico. Los valores se representaron en un gráfico de líneas con barras de error que muestran la desviación estándar.

El compuesto HE9 redujo significativamente la replicación del ARN viral (ARNv) entre los tres compuestos estudiados y se evaluó adicionalmente para determinar las concentraciones efectivas que pueden reducir no solo los niveles de ARNv sino también las partículas infecciosas del virus SARS-CoV-2 aplicando una inhibición del efecto citopático (CPE). ensayo (Fig. 4c). Un compuesto activo era aquel que mostraba una inhibición de CPE de >50% sin comprometer la viabilidad celular. No pudimos ajustar una curva sigmoidea a los datos de los compuestos HBA e YRL. Es importante destacar que el tratamiento de las células con el compuesto HE9 redujo la replicación viral y mostró una capacidad para inhibir el CPE con IC50 = 10 µM (Fig. 4c). Estos resultados de los ensayos celulares están en línea con los estudios enzimáticos in vitro que utilizan ensayos de deISGlyación y demuestran claramente que el compuesto HE9 es un inhibidor potencial de PLpro, que puede proteger a las células huésped del CPE viral.

PLpro de SARS-CoV, MERS-CoV y otros coronavirus es capaz de inactivar los componentes del interferón tipo I mediado en parte por sus funciones de desubiquitinación y deISGilación5,25. Una característica única de las células Vero es que tienen deficiencia de interferón y carecen de la producción de interferones tipo I (IFN), las proteínas de señalización antivirales producidas típicamente por células de mamíferos50 y que se sabe que expresan fuertemente ISG15. De este modo, la viabilidad celular, la inhibición de la replicación viral en un rango micromolar y la inhibición efectiva del efecto citopático en presencia de HE9 en células Vero se modularon a través de una vía celular alternativa durante la infección por SARS-CoV-2.

Estudios recientes que utilizan protocolos celulares similares para evaluar la replicación del SARS-CoV-2 con la línea celular Vero han informado una curva de replicación viral estable entre 24 y 40 h después de la infección, seguida de una disminución evidente de la replicación y un fuerte efecto citopático. sobre la viabilidad celular51. Esta observación no se observó en nuestro estudio cuando el compuesto HE9 se tituló en la misma línea de células Vero. En el mismo estudio, se detectó una inhibición significativa de la replicación viral cuando las células Vero se infectaron con SARS-CoV-2 y se trataron de forma independiente con IFN-β1a e IFN-α (IFN tipo I). Además, el tratamiento de células Vero no infectadas con interferón humano tipo III (IFN-λ1) estimuló la expresión celular endógena de otros ISG, como MxA (proteína de resistencia a mixovirus), PKR (proteína quinasa R), OAS-1 (2′, 5′-oligoadenilato sintetasa), SOCS-1 (supresor de señalización de citocinas 1) y Rig-1 (gen I inducible por ácido retinoico)52,53, lo que sugiere que las células Vero, incluso desprovistas de IFN tipo I, pueden provocar IFN funcional III respuestas54. Por lo tanto, el compuesto HE9 podría atenuar indirectamente la actividad viral al revertir los eventos de desubiquitinación del huésped relacionados con la deficiencia de la respuesta de IFN en las células Vero.

Hemos identificado tres compuestos fenólicos que inhiben PLpro uniéndose a un sitio alostérico S2, una región de interacción y unión para la molécula ISG15. Los tres compuestos muestran inhibición de PLpro en un ensayo de deISGilación y no demuestran inhibición en un ensayo de actividad enzimática realizado con la proteasa principal, Mpro. Curiosamente, dos compuestos exhiben una actividad antiviral distinta en los ensayos de líneas celulares Vero y un compuesto inhibió adicionalmente un efecto citopático en rangos de concentración no citotóxicos. Las afinidades de unión para los tres compuestos están en el rango micromolar inferior, lo que indica que los compuestos son aglutinantes débiles para PLpro, pero ciertamente proporcionan valiosos soportes iniciales como compuestos principales que se dirigen a un sitio de unión alostérico en PLpro. Los estudios de acoplamiento molecular con los tres compuestos fenólicos, ya sea unidos covalentemente o extendidos con las estructuras de tiosemicarbazona, muestran un aumento de las energías de unión previstas de 0,8 a 1,8 kcal/mol en comparación con los compuestos iniciales no extendidos55. Por lo tanto, las afinidades y especificidades de unión observadas de los tres compuestos pueden mejorarse mediante un análisis sistemático de SAR (relación estructura-actividad).

En resumen, las estructuras del complejo PLpro de alta resolución con compuestos fenólicos naturales YRL, HBA y HE9 complementadas con ensayos enzimáticos y celulares, proporcionaron una base molecular para comprender el mecanismo inhibidor, una ruta para desarrollar inhibidores PLpro eficaces de los sustratos que se unen al PLpro. Bolsillo de unión de la hélice S2 y arroja luz sobre el modo de ISGilación de las proteínas virales COVID-19 como un nuevo enfoque para prevenir su interacción con las vías celulares del huésped humano. Creemos que este enfoque para inhibir PLpro puede obstaculizar y reducir la capacidad viral para realizar la deISGilación en las complicaciones virales posteriores a COVID-19, además de proporcionar más ISG15 dentro de los tejidos pulmonares para la modulación de la producción de citocinas/quimiocinas, para apoyar la reparación de el epitelio respiratorio dentro de las infecciones por COVID-1911.

Un fragmento de ORF pp1a/ab del SARS-CoV-2 que codifica el dominio PLpro y que corresponde a los aminoácidos 746-1060 de la proteína no estructural 3 (YP_009742610.1) se clonó en pETM11 (EMBL), que codifica hexa-terminal N-terminal. su etiqueta seguida de un sitio de escisión de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV). Después de la escisión mediante la proteasa TEV, quedan dos aminoácidos (GA) adicionales en el extremo N del constructo PLpro. El plásmido que codifica la construcción deseada se transformó en células de E. coli Rosetta (DE3) (Merck, Alemania) para realizar la expresión mediante medio de autoinducción, esencialmente como se describió anteriormente56 y usando kanamicina para la selección. Se diluyó un cultivo celular durante la noche y se incubó en medio de autoinducción que contenía 0,5 g L-1 de β-D-glucosa y 2 g L-1 de lactosa en agitación constante durante 4 h a 37 °C y luego en presencia de ZnCl2 100 µM adicionalmente sobre -noche a 18 °C. Posteriormente, las células se recogieron mediante centrifugación y se rompieron mediante sonicación en tampón de lisis (NaH2PO4 50 mM, NaCl 150 mM e imidazol 10 mM, pH 7,2).

Los extractos celulares se mantuvieron a 4 ° C y se centrifugaron a 12.000 x g durante 1 h. El sobrenadante transparente se incubó con resina de afinidad Ni-NTA (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.). PLpro se eluyó mediante flujo por gravedad utilizando tampón de lisis suplementado con imidazol 300 mM y posteriormente se incubó con proteasa TEV en una relación molar de 20:1 en presencia de DTT 1 mM. La escisión se realizó durante la diálisis contra Tris 50 mM, NaCl 150 mM y DTT 1 mM ajustado a pH 7,3 y durante 14 h a 8 °C. Después de eliminar la proteasa y la etiqueta escindida mediante cromatografía de afinidad, PLpro se purificó hasta homogeneidad utilizando cromatografía de exclusión por tamaño, es decir, una columna HiLoad 16/600 Superdex 75 conectada a un purificador ÄKTA (GE Healthcare, GB) equilibrada con Tris 50 mM, 150 NaCl mM y TCEP 1 mM a pH 7,5. La pureza y la integridad de la proteína se verificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS y DLS (dispersión dinámica de luz). La concentración de PLpro con un peso molecular calculado de 35.760 Da (εcalculado = 45.270 M-1 cm-1) se ajustó a 20 mg mL-1 en preparación para los ensayos de cristalización por difusión de vapor.

Los experimentos iniciales de detección de cristalización se realizaron utilizando el método de difusión de vapor en gota sentada utilizando el robot Oryx4 (Douglas Instruments) con las placas SWISSCI de 96 pocillos. Se probaron las formulaciones de cristalización Wizard™ Classic 1, 2, 3 y 4, JCSG+, PACT para experimentos de detección iniciales. La cristalización se realizó con una relación proteína:depósito de 2:1 a 4 y 20 °C. Los resultados iniciales se obtuvieron de la pantalla Wizard, condición G11 (tampón acetato 0,1 M, pH 4,5, NaH2PO4 0,8 M/K2HPO4 1,2 M) a 4 °C. Se realizó una optimización adicional cambiando el tampón a Tris-HCl 0,1 M, pH = 8,0 e incluyendo glicerol al 10%, lo que dio como resultado cristales bipiramidales de 0,2 a 0,3 mm. Estos cristales difractaron rayos X con una resolución de 1,42 Å.

Los cristales del complejo PLpro con compuestos se cultivaron mediante el método de cocristalización utilizando las mismas condiciones resumidas anteriormente. Se aplicaron gotitas de 100 nl de soluciones de compuestos 10 mM en DMSO de la biblioteca de compuestos naturales de Sadia Molecular Bank, Karachi, sobre una placa SWISSCI de 96 pocillos y los compuestos se secaron al vacío antes de la adición de 200 nl de (20 mg/ml) Solución de proteína PLpro y 100 nL de la condición de cristalización (tampón Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0, NaH2PO4 0,8 M/K2HPO4 1,2 M y glicerol al 10%). Las gotas se equilibraron en un sistema de difusión de vapor de gotas sentadas con 80 µl de solución de depósito. Las placas se incubaron a 4 °C y en 2 días aparecieron cristales que crecieron de forma reproducible hasta dimensiones de aprox. 0,2 × 0,3 × 0,2 mm3 en 4 días. Los cristales se recolectaron manualmente directamente de la gota y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido para la recopilación de datos de difracción.

Los datos de difracción de los cristales de PLpro complejos y libres de ligando se recogieron en la línea de luz P11, PETRA III/DESY, Hamburgo. Todos los conjuntos de datos de PLpro sin ligando se procesaron utilizando el programa XDS57 con un conjunto de datos de referencia para garantizar una indexación consistente. De un total de 64 conjuntos de datos completos, los más fuertes se seleccionaron en función de (I/σ)asintótico mayor que 2058. Estos 25 conjuntos de datos luego se sometieron a una fusión iterativa utilizando la ejecución CODGAS59 con parámetros estándar. Los mejores conjuntos de datos combinados se filtraron manualmente, lo que condujo al conjunto de datos final que contenía cinco conjuntos de datos. Estos se escalaron con XSCALE57 y la fusión final y el corte de resolución se aplicaron utilizando AIMLESS60. La solución de la estructura se logró mediante el método de reemplazo molecular con PHASER61 utilizando las coordenadas PLpro con el código PDB 7JRN como modelo de búsqueda. Rondas sucesivas de construcción manual con el programa COOT62 y refinamiento con PHENIX63, la adición de fosfato, glicerol, iones cloruro y moléculas de solvente de agua al modelo, seguidas de una ronda final de refinamiento TLS completaron el refinamiento de la estructura con una resolución de 1,42 Å. .

Se utilizó un proceso automático de procesamiento de datos, búsqueda de resultados, agrupación64, análisis PanDDA65 y protocolos de refinamiento como se describió anteriormente4 para la solución estructural y el análisis de PLpro en complejo con los compuestos naturales de la biblioteca que consta de 500 compuestos. El procesamiento de datos con XDS dio como resultado 1469 conjuntos de datos e incluye más de un conjunto de datos por compuesto. Los indicadores de calidad de los datos CC1/2 y los factores B de Wilson se trazan como se muestra en la Fig. S7. Las rondas finales de refinamiento manual con Refmac66 o Phenix67 junto con la construcción manual del modelo aplicando COOT dieron como resultado las estructuras refinadas finales. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos para PLpro y complejos se resumen en la Tabla 1, información complementaria. Todas las figuras fueron preparadas usando PyMol68.

Se realizaron ensayos de actividad para la enzima nativa y mutante PLpro del SARS-CoV-2 (mutante PLpro C111S) para determinar las actividades de deISGilación y desubiquitinación efectuadas por los tres compuestos naturales, siguiendo protocolos publicados previamente26,27,47. Los ensayos se realizaron con un volumen de reacción total de 100 µl en una placa de 96 pocillos, de fondo negro y sin unión, y las reacciones se midieron en un lector de placas Tecan Infinite M plus (Tecan Group Ltd, Suiza) utilizando ajustes ópticos específicos para ISG15. -Rodamina (UbiQ-127, UbiQ Bio) y Ubiquitina-Rodamina (UbiQ-126, UbiQ Bio). ISG15-Rodamina y Ub-Rodamina son sustratos fluorogénicos que contienen la secuencia de escisión RLRGG reconocida por PLpro en el extremo C-terminal. La escisión del enlace amida entre el residuo de glicina terminal y el fluoróforo de rodamina110 libera el Rh110-morfolinacarbonilo fluorescente que da como resultado un aumento de la intensidad de la fluorescencia, medida como RFU (Unidad de Fluorescencia Relativa). El fluoróforo tiene excitación y emisión a 492 y 525 nm respectivamente. El sustrato ISG15 (UbiQ-127) y el sustrato Ub (UbiQ-126) se usaron a una concentración final de 100 nM y la concentración de PLpro fue de 10 nM en el ensayo. Se utilizó sustrato relevante y controles positivos (GRL0617) durante todo el ensayo. Los sustratos, mutantes y nativos de PLpro del SARS-CoV-2 se diluyeron en tampón de ensayo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 1 mM) y las reacciones se iniciaron tras la adición de PLpro en un volumen final de 100 µL y medido a 25°C. Los supuestos compuestos inhibidores se incubaron con la enzima PLpro a 10 °C durante 6 h. La cinética de inhibición se midió por triplicado durante 60 minutos con una lectura por minuto en dos experimentos independientes. Los valores de fluorescencia medidos se corrigieron en blanco con un tampón que contenía los sustratos ISG15-Rodamina o Ub-Rodamina, respectivamente.

La determinación de la CI50 se realizó con ISG15-rodamina como sustrato a una concentración de 250 nM. Los ensayos se realizaron como se describió anteriormente, sin embargo, se usó un gradiente de concentración de los tres compuestos naturales y GRL-0617 en una concentración que oscilaba entre 2 y 50 µM en la mezcla de reacción antes de la incubación. Los valores de CI50 se calcularon mediante la función dosis-respuesta-inhibición después de la normalización de los valores de actividad enzimática. Se utilizaron Microsoft Excel y GraphPad Prism (versión 8.3.1) para analizar los resultados y preparar las figuras correspondientes.

Se cultivaron líneas celulares Vero (ATCC® CCL-81™) en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo, después de 24 h de incubación a 37 °C y una atmósfera de CO2 al 5%. Se cambiaron los medios de cultivo celular y se añadieron diluciones en serie diez veces mayores de los compuestos. La viabilidad celular después de 72 h de tratamiento de las células con los compuestos respectivos se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega), siguiendo las instrucciones del fabricante. La señal luminiscente se registró utilizando un lector de microplacas multimodo CLARIOstar (BMG Labtech, Alemania). Los datos se obtuvieron de tres réplicas independientes en tres experimentos biológicos. Se eliminaron las muestras que se consideraron fallas técnicas y valores atípicos extremos. Los pocillos que contenían sólo medio de cultivo sirvieron como control para determinar el fondo del ensayo.

Se sembraron líneas celulares Vero (ATCC® CCL-81™) cultivadas en DMEM suplementado con 10% de FBS en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo, después de 24 h de incubación a 37 °C y una atmósfera de 5% de CO2. . Se cambió el medio de cultivo celular y se añadió a las células una dilución en serie diez veces mayor de los compuestos. Los ensayos se realizaron como se publicó anteriormente4. Brevemente, después de 1 h de incubación, se añadió a las células la cepa 69 del SARS-CoV-2, diluida en DMEM con FBS al 2,5 % a una MOI de 0,01 y se permitió la absorción durante 1 h. Se eliminó el inóculo viral y las células se lavaron suavemente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio. Se volvió a añadir a las células DMEM fresco con FBS al 2,5% que contenía los compuestos. El sobrenadante del cultivo celular se recogió 42 h después de la infección y el ARN viral se purificó utilizando el kit de aislamiento de ácido nucleico viral/patógeno MagMAX™ (Thermo Fisher Scientific). Las muestras se procesaron utilizando la plataforma semiautomática NucliSENS® easyMag® ​​(bioMérieux, Lyon, Francia), siguiendo las instrucciones del fabricante. Todas las infecciones por SARS-CoV-2 se realizaron en un laboratorio de nivel 3 de bioseguridad del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo, Brasil. Los títulos virales se determinaron mediante el método qRT-PCR utilizando el kit AgPath-ID™ One-Step RT-PCR (Thermo Fisher Scientific) y una secuencia de cebadores y sonda para el gen E70. Los títulos virales se calcularon utilizando una curva estándar generada con diluciones en serie de una concentración conocida del molde y expresada en TCID50/ml. Se utilizaron como control células infectadas con la adición de DMSO al 0,5%. Los valores de CI50 se calcularon ajustando los datos utilizando GraphPad Prism versión 8.00 (GraphPad Software, La Jolla California, EE. UU.). Los datos se obtuvieron de cuatro réplicas independientes en dos experimentos biológicos. Se eliminaron las muestras que se consideraron fallas técnicas y valores atípicos extremos.

Se sembraron líneas celulares Vero (ATCC® CCL-81™) cultivadas en DMEM suplementado con 10% de FBS en placas de 96 pocillos a una densidad de 3,5 x 104 células/pocillo, después de 24 h de incubación a 37 °C y una atmósfera de 5% de CO2. . Se cambió el medio de cultivo celular y se añadió a las células una dilución en serie diez veces mayor de los compuestos. Las células se infectaron a una MOI de 0,01 y la inhibición del efecto citopático (CPE) después de 42 h de tratamiento de las células con los compuestos respectivos se determinó mediante el ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter-Glo® (Promega). La señal luminiscente se registró utilizando un lector de microplacas multimodo CLARIOstar (BMG Labtech, Alemania). Los datos se obtuvieron de tres réplicas independientes en un experimento biológico. Se eliminaron las muestras que se consideraron fallas técnicas y valores atípicos extremos.

El ensayo basado en luminiscencia mide la inhibición del efecto citopático (CPE) inducido por el SARS-CoV2 en la línea celular Vero (ATCC® CCL-81™)49. El porcentaje de inhibición del efecto citopático (CPE) se definió como [(compuesto de prueba-control de virus)/(control celular-control de virus)] × 100. Los valores de IC50 se ajustaron mediante la función sigmoidal usando GraphPad Prism versión 8.00 (GraphPad Software, La Jolla California EE.UU. ).

Las mediciones de nDSF se realizaron aplicando un fluorímetro Nanotemper Prometheus NT.48 (Nanotemper) operado por el software PR.ThermControl y utilizando capilares de grado Prometheus Premium (Nanotemper). La potencia de excitación se ajustó para obtener señales de fluorescencia por encima de 2000 RFU para un rango de longitud de onda de 330 y 350 nm. Para todas las mediciones se utilizó una concentración de PLpro de 50 μM en el tampón que consta de Tris-HCl 20 mM, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM, pH 8,0 y concentraciones variables de ligando. Para el ligando HE9 se añadió DMSO al 0,5% para garantizar la solubilidad. Para las valoraciones de fluorescencia se diseñó una serie de diluciones 1:1 con 16 puntos de ligandos y luego se agregaron las soluciones proteicas correspondientes. Las concentraciones de ligando varían de 20 mM a 610 nM para HBA y de 5 mM a 153 nM para HE9. Después de una incubación de 30 minutos, las soluciones se transfirieron a capilares y se utilizaron para las mediciones. Los datos se analizaron y visualizaron aplicando scripts de Python autoescritos utilizando los módulos de Python Numpy, Matplotlib, Scipy y Pandas y una plataforma de análisis de datos SPC disponible públicamente.46 Los valores de fluorescencia F frente a la concentración de ligando [L]0 de HBA y HE9 fueron equipados con un modelo de unión simple 1:1 usando las Ecs. (1) y (2) a continuación:

Se realizaron ensayos de actividad para SARS-CoV-2 Mpro16,71 utilizando los tres compuestos naturales, con el objetivo de caracterizar la especificidad de los compuestos hacia PLpro. Los ensayos se realizaron aplicando un volumen de reacción total de 50 µl usando placas de 96 pocillos de fondo negro sin unión y la fluorescencia relativa se midió utilizando un lector de placas Tecan Infinite M plus (Tecan Group Ltd, Suiza) usando ajustes ópticos específicos para el sustrato 2-AbzSAVLQSGTyr(3-NO2)R-OH (Biotrend). El fluoróforo correspondiente tiene una excitación y emisión a una longitud de onda de 355 nm y 460 nm respectivamente. El sustrato y Mpro se usaron a una concentración final de 5 µM y 75 nM respectivamente. El conocido inhibidor de Mpro (GC-376) se utilizó como control positivo durante todo el ensayo. SARS-CoV-2 Mpro y los sustratos se diluyeron en tampón de ensayo (Tris-HCl 20 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) y las reacciones se iniciaron tras la adición de Mpro en un volumen final de 50 µL y se midieron a 25 °C. Los tres compuestos se incubaron antes de los experimentos con Mpro a 10 °C durante 6 h, como se realizó también para los ensayos de actividad de PLpro. Los valores de fluorescencia se midieron durante 15 minutos con una lectura por minuto.

La determinación de la CI50 se realizó aplicando el mismo sustrato a una concentración de 5 µM y los ensayos correspondientes se realizaron como se describió anteriormente. Se utilizó un gradiente de concentración en un rango de 1 nM a 150 µM para los tres compuestos naturales y GC-376. Los valores de CI50 se calcularon aplicando una función dosis-respuesta-inhibición después de la normalización de los valores de actividad enzimática. Para el análisis de los datos obtenidos se utilizó Microsoft Excel y el software Origin (OriginLab) para elaborar las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las coordenadas y los factores de estructura se depositaron en el Protein Data Bank PDB, con códigos: 7NFV (PLpro), 7OFS (PLpro en complejo con YRL, 4-(2-hidroxietil)fenol), 7OFT (PLpro en complejo con HBA, p-hidroxibenzaldehído ) y 7OFU (PLpro en complejo con éster metílico del ácido HE9,3,4-dihidroxibenzoico).

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Los autores dedican este artículo en honor al 80 cumpleaños del Prof. Dr. Atta-ur-Rahman, fundador del ICCBS (Centro Internacional de Ciencias Químicas y Biológicas), Karachi, Pakistán, por sus contribuciones científicas y su trabajo en la investigación y el avance de productos naturales. de la ciencia y promoción de los jóvenes científicos. Agradecemos a Deutsche Elektronen-Synchrotron (DESY, Hamburgo, Alemania), miembro de la Asociación Helmholtz HGF, por el suministro de instalaciones experimentales, el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) a través de los proyectos 05K2020, 05K19GU4, 13K20GUB, 05K19GU1, el Joachim-Herz-Stiftung Hamburg (proyecto Infecto-Physics), la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, proyectos 2015/26722-8 y 2020/12277-0) y la red de colaboración entre las Universidades de São Paulo ( USP) y Hamburgo (UHH) a través del Proyecto Sprint UHH-USP-FAPESP 2019 (FAPESP 2019/00899-0) y la empresa conjunta USP-UHH “4D - From Drug Discovery to Drug Delivery”. Los autores también agradecen el apoyo del Grupo de Excelencia 'Advanced Imaging of Matter' de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - EXC 2056 - proyecto ID 390715994. También agradecemos las contribuciones de los colaboradores de ICCBS, Prof. Dr. M. Iqbal Choudhary, Prof. Dr. Bina S. Siddiqui, Prof. Dr. Shaiq Ali, Prof. Dr. Sabira Begum y Prof. Dr. Atia-tul-Wahab por proporcionar la biblioteca de compuestos mencionados en este manuscrito.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Departamento de Química, Instituto de Bioquímica y Biología Molecular, Laboratorio de Biología Estructural de Infecciones e Inflamaciones, Universität Hamburg, Build. 22a, c/o DESY, 22607, Hamburgo, Alemania

Vasundara Srinivasan, Hevila Brognaro, Prince R. Prabhu, Sven Falke, Nadine Werner, Hina Andaleeb, Najeeb Ullah, Bruno Alves Franca, Mengying Wang, Angelica Luana C. Barra, Markus Perbandt, Martin Schwinzer y Christian Betzel

Centro de Imágenes Ultrarrápidas de Hamburgo (CUI), Universidad de Hamburgo, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburgo, Alemania

Príncipe R. Prabhu, Thomas J. Lane, Arwen R. Pearson, Henry N. Chapman y Christian Betzel

Departamento de Parasitología, Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil

Edmarcia Elisa de Souza & Carsten Wrenger

Centro de ciencia del láser de electrones libres, CFEL, Deutsches Elektronen Synchrotron DESY, Notkestrasse 85, 22607, Hamburgo, Alemania

Sebastian Günther, Patrick YA Reinke, Thomas J. Lane, Wiebke Ewert, Janina Sprenger, Faisal HM Koua, Sven Falke, Oleksandr Yefanov, Julia Lieske, Luca Gelisio, Martin Domaracky, Philipp Middendorf, Michael Groessler, Fabian Trost, Marina Galchenkova, Aida Rahmani Mashhour, Henry N. Chapman y Alke se reúnen

Diamond Light Source Ltd. Diamond House, Harwell Science and Innovation Campus, Didcot, OX11 0DE, Reino Unido

Helen Ginn

Europea XFEL GmbH. Holzkoppel 4, 22869, Schenefeld, Alemania

Huijong Han, Christina Schmidt, Lea Brings, Kristina Lorenzen y Robin Schubert

Departamento de Bioquímica, Universidad Bahauddin Zakariya Multan-, 60800, Punjab, Pakistán

Hina Andaleeb y Najeeb Ullah

TerRa Pole, Instituto de Física de São Carlos, Universidad de São Paulo, São Carlos, Brasil

Angélica Luana C. Barra

Departamento de Microbiología, Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo, São Paulo, Brasil

Rafael Rahal Guaragna Machado, Erika Donizette Candido, Danielle Bruna Leal Oliveira & Edison Luiz Durigon

Laboratorio Clínico, Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, Brasil

Danielle Bruna Leal Oliveira

Plataforma Científica Pasteur USP, São Paulo, Brasil

Edison Luiz Durigon

Laboratorio Europeo de Biología Molecular de Hamburgo, c/o DESY, Notkestrasse 85, 22607, Hamburgo, Alemania

Stephan Niebling, Angelica Struve Garcia & Maria Garcia Alai

Photon Science, Sincrotrón de electrones alemán (DESY), Notkestrasse 85, 22607, Hamburgo, Alemania

Sofiane Saouane y Johanna Hakanpää

Instituto Fraunhofer de Medicina Traslacional y Farmacología (ITMP), Schnackenburgallee114, 22525, Hamburgo, Alemania

Marcos Lobo

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Estructural, Instituto Jozef Stefan, Jamova 39, 1 000, Ljubljana, Eslovenia

turco dusan

Centro de excelencia para enfoques integrados en química y biología de proteínas (CIPKEBIP), Jamova 39, 1 000, Ljubljana, Eslovenia

turco dusan

Instituto de Nanoestructura y Física del Estado Sólido, Universidad de Hamburgo, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburgo, Alemania

Arwen R. Pearson

Departamento de Física, Universidad de Hamburgo, Luruper Chaussee 149, 22761, Hamburgo, Alemania

Henry Chapman

Instituto de Bioquímica, Universidad de Greifswald, Felix-Hausdorff-Str. 4, 17489, Greifswald, Alemania

Winfried Hinrichs

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Investigación diseñada por VS, HB, EES, HNC, ARP, AM, CW y CB. VS, HB, PRP, EES, HNC, CW y CB escribieron el manuscrito. HH, NW, SF, BNF, MW, ALCB, ARM y MW participaron en la preparación de la muestra. VS realizó experimentos de cristalización. VS, S. Günther, PR, JL, OY, SS, JH, HA, NU, MP, MS, FHMK, WE, JS, SF, M. Groessler, FT y M. Galchenkova realizaron la recolección de datos de rayos X. VS, TJL, HG, S. Günther, PR, WE, JS, FHMK, DT y WH realizaron análisis de datos de rayos X. KL, LB, CS, HH, RS, LG, MD y PM realizaron la gestión de datos de rayos X. VS, HB, PRP y PR realizaron y analizaron ensayos de actividad enzimática PLpro y Mpro. EES, RRGM, EDC, DBLO y ELD realizaron y analizaron ensayos de actividad antiviral. MGA, SN y ASG realizaron y analizaron estudios de unión de nanoDSF.

Correspondencia a Vasundara Srinivasan o Christian Betzel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Rui Xiong y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Srinivasan, V., Brognaro, H., Prabhu, PR et al. Actividad antiviral de compuestos fenólicos naturales en complejo en un sitio alostérico de la proteasa similar a la papaína del SARS-CoV-2. Común Biol 5, 805 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03737-7

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Recibido: 15 de diciembre de 2021

Aceptado: 18 de julio de 2022

Publicado: 11 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03737-7

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